實(shí)體組織分散為單個(gè)細(xì)胞的實(shí)例
Pallavivini為了進(jìn)行細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)分析，分散實(shí)體瘤常用中性蛋白酶處理細(xì)胞，具體步驟是：
1、配制中性蛋白酶（Neutral Protease）（Boehringer—Mannheim，Indiapolis，IN）消化液：以1mg/ml的濃度將中性蛋白酶溶解在無(wú)鈣離子的PBS中（pH7.4），3g瘤組織約需要25ml消化液。
2、取下瘤塊在冷PBS中截成幾小塊，再轉(zhuǎn)入中性蛋白酶中，剪碎瘤塊。
3、37℃恒溫振蕩1小時(shí)。
4、將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液，用PBS離心洗兩次。
5、棄上清，將細(xì)胞沉淀打勻，用注射器或細(xì)吸管將細(xì)胞噴入預(yù)冷的70%乙醇中固定。
6、至少固定細(xì)胞12小時(shí)后，即可進(jìn)行染色。
Pallavivini比較了中性蛋白酶、胰酶加DNA酶兩種酶處理KHT實(shí)體瘤分散單個(gè)細(xì)胞的效果，為了比較分散的細(xì)胞群體中各周期時(shí)相的分布，將接種實(shí)體瘤的小鼠注射3H—胸腺嘧啶核苷，然后取一半瘤用來(lái)比較兩種酶處理的效果，另一半瘤被固定后制備成組織切片，通過(guò)放射自顯影比較酶分散的細(xì)胞懸液中和組織切片中細(xì)胞的標(biāo)記指數(shù)。比較的結(jié)果是：兩種酶消化處理的細(xì)胞懸液和組織切片獲得的標(biāo)記指數(shù)沒(méi)有顯著的不同，但表明兩種酶處理對(duì)獲得含量較小的亞群都不夠敏感。此外，兩種酶處理比較的其它結(jié)果是：用中性蛋白酶處理，比DNA酶加胰酶混合酶處理小鼠KHT肉瘤所形成的單個(gè)細(xì)胞，在體內(nèi)或體外克隆形成力高約1.5倍，細(xì)胞產(chǎn)額高約2倍。用兩種酶處理所得到的DNA分布圖質(zhì)量都很高，變異系數(shù)約為3—5%，碎片和叢結(jié)都較少。因此，對(duì)于KHT肉瘤細(xì)胞，兩種酶處理法都是可行的。
實(shí)體組織分散為單個(gè)細(xì)胞的另一個(gè)例子是美國(guó)Roche-ster醫(yī)科大學(xué)耿中平等人對(duì)3種動(dòng)物瘤和4種人的實(shí)體瘤進(jìn)行了實(shí)體瘤分散實(shí)驗(yàn)。他們發(fā)現(xiàn)，只用機(jī)械法分散實(shí)體瘤速度快，但細(xì)胞失活率大。他們用4種酶消化液進(jìn)行了一些對(duì)比實(shí)驗(yàn)，消化結(jié)果表明，3種酶混合液的效果大大優(yōu)于膠原酶，而膠原酶又優(yōu)于胰酶加DNA酶，使用胰酶效果最差。效果好的酶對(duì)于宿主細(xì)胞而言，可以獲得較高比例的瘤細(xì)胞，較高比例的S期和G2M期細(xì)胞和較高的克隆形成能力。下面介紹他們的實(shí)體瘤分散步驟：
（1）、從動(dòng)物身上取瘤后，立即投入4℃含有10%小牛血清的消毒的培養(yǎng)介質(zhì)中。
（2）、取0.2—0.5g瘤組織并切碎。
（3）、將切碎的瘤組織放入一個(gè)盛有25ml 3種酶混合液的瓶中，濃度見(jiàn)前。
（4）、37℃恒溫消化30—60分鐘。消化后過(guò)濾，再將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液在400g下離心10分鐘。
（5）、棄去混合液，用含10%小牛血清的新鮮組織培養(yǎng)液將已被分散的瘤細(xì)胞洗兩次。
（6）、將細(xì)胞重新懸浮在完全的組織培養(yǎng)介質(zhì)中。
技術(shù)支持: