單克隆抗體在臨床應(yīng)用中存在的主要問題及解決方法

自從McAb問世以來，放射免疫顯像和放射免疫治療研究才真正活躍起來。20多年來，人們研制出許多中McAb,相應(yīng)地進行了很多RII和RIT的研究和嘗試，取得了很大成績，技術(shù)上有許多進步，經(jīng)驗上有豐富的積累。但是也遇到了一些問題，主要有以下幾個方面。

一、人抗鼠抗體的產(chǎn)生

迄今人源化McAb雖然進行了許多研究，但據(jù)臨床應(yīng)用還有較大距離。目前臨床應(yīng)用的基本上都是鼠源性的。它對人體是一種異種蛋白質(zhì)，進入人體后很可能引起人體對此異物的免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是當反復(fù)注射的更是如此，產(chǎn)生抗抗體，即人抗鼠抗體（human antimouse antibody,HAMA).標記完整McAb,進入機體后，約有50%的人立即產(chǎn)生HAMA。還有注射7-10天后出現(xiàn)HAMA。HAMA在體內(nèi)可維持半年至一年半。HAMA的產(chǎn)生不僅對病人造成不良作用，例如HAMA滴度高的病人，有可能引發(fā)III型變態(tài)反應(yīng)，對第二次給藥造成困難，而且還影響靶組織對McAb的攝取量和McAb在體內(nèi)的分布于代謝。若血HAMA濃度＜15%，對顯像影響不大，若＞20%，則約有90%的標記抗體與HAMA結(jié)合，形成免疫反應(yīng)復(fù)合物，隨后被機體消除。標記抗體在血中半排期縮短，游離抗體濃度降低，減少了與靶細胞結(jié)合機會，從而使顯像困難。另外，所形成的面議反應(yīng)復(fù)合物被單核巨噬細胞吞噬后，還會引起肝、脾本底的增加，同樣葉穎賢顯像效果。目前避免或減輕HAMA反應(yīng)的措施主要有以下集中。

1、使用抗體片段 鼠源抗體恒定區(qū)是產(chǎn)生HAMA的主要免疫源，可誘發(fā)人體產(chǎn)生抗同種型抗體，這是HAMA的主要成分�？贵w片段的免疫原性弱，但反復(fù)使用，也會產(chǎn)生抗獨特型抗體，它占HAMA的20%-80%，平均為40%。但是也有人認為抗體片段基本上不誘導(dǎo)HAMA產(chǎn)生。總之，至少抗體片段產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)要小得多。

2、使用免疫抑制劑 在注射康提前，先用免疫抑制藥，以避免或減小免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3、先注入同種型無關(guān)抗體 由于HAMA的主要成分是抗同種型抗體，在注射標記抗體前，先注入同種型無關(guān)抗體結(jié)合HAMA，形成復(fù)合物，排出體外。

4、利用血漿清除術(shù) 本法可使接受放射免疫治療的病人HAMA滴度明顯降低。

5、研究和應(yīng)用基因工程抗體 利用基因工程制備注入單鏈抗體（single chain Fv fragment,sefv）、多價微型抗體、單區(qū)抗體、互補決定區(qū)、嵌合抗體、人源化抗體和人源抗體等，是McAb真正進入臨床應(yīng)用的希望所在。

二、提高靶/非靶(T/NT)的放射性比值

RII是一個生物動態(tài)過程，受很多因素影響從而使本底升高，使T/NT比值降低。以腫瘤RII為例，由于腫瘤細胞表達的多數(shù)抗原既不是器官特異的，也不是腫瘤特異的，注入體內(nèi)的放射性僅有一小部分（約0.01%=0.001%）最終集中于腫瘤，而其余大部分則出現(xiàn)在血、肝、脾和腎等器官中，體積較小的和位于特殊臟器的腫瘤顯像受到限制。正常組織的高本底、當用I標記時，主要出現(xiàn)在血和胃；當用In標記時，主要出現(xiàn)在肝和脾等臟器。

為提高T/NT比值、增強圖像清晰度，提高探測率，過去的研究多立足于努力提高標記抗體在腫瘤內(nèi)的濃聚、但收效不大。目前集中于降低本底放射性上，特別是In形成的肝臟和血中的本底放射性。以采取的方法有多種，例如相減技術(shù)、脂質(zhì)體第二抗體和標記McAb片段等，但效果不甚顯著。

降低本底放射性研究的新進展是預(yù)定位閃爍現(xiàn)象（pre-targeted scintigraphy)技術(shù)或預(yù)著靶免疫閃爍顯像（pretargeted immumno-scintigraphy)技術(shù)。其基本原理是：首先注射未經(jīng)放射性核素標記的抗體，待其余腫瘤組織幾何且正常組織本地消退后，再注入放射性核素標記的小分子化合物，它既能快速自血中清除，又能通過某種機制使抗體與小分子化合物在腫瘤部位幾何，從而提高T/NT比值，改善顯像。預(yù)定位技術(shù)有幾種，其中研究和應(yīng)永得最多的、效果也最好的是1987年引入的生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system,BAS).

1、生物素、親和素和鏈霉素親和素 生物素又稱維生素H或輔酶R，是小分子物質(zhì)、分子量為244、等電點PH為3.5，分子式為C10H16O3N2S.分子結(jié)構(gòu)中有咪唑酮環(huán)基，是與親和素（acidin，AV或鏈霉親合素（streptavidin,SA)上色氨酸殘基結(jié)合的主要部位。另一四氫噻吩環(huán)的C2上有一側(cè)鏈，其末端羧基是標記抗體和酶的唯一結(jié)構(gòu)。每個IgG分子可以標記數(shù)十個用化學(xué)方法活化的生物素分子，因此凡有生物素衍生物的反應(yīng)層就是一個放大級。

AV又稱抗生素蛋白或抗生素，其分子量約為66000，等電點PH約為10，是一種對生物素具有極高親和力和特異性的蛋白質(zhì)。而通常抗體與抗原間的親和實力約為�？梢娚�物素與親和素間的親和力約為抗體與抗原間的親和力的1-100萬倍。因此生物素與親和素結(jié)合快速，而且復(fù)合物十分穩(wěn)定，在一般條件下極少解離。

SA是與AV具有相似的生物學(xué)特性的蛋白質(zhì)，分子量為60000.完整的SA與AV一樣，由四條相同的含有128個氨基酸的肽鏈所組成。肽鏈之間由二硫鍵鏈接。每條肽鏈可結(jié)合一個生物素分子，因此一個SA與AV分子可結(jié)合四個生物素分子，從而具有生物放大作用。SA與AV一樣，與生物素具有極高的親和力，兩者對生物素的親和常數(shù)很接近。SA的活性以每毫克SA所結(jié)合的生物素的微克數(shù)表示，活性15ug/mg。SA對熱的耐受性較強。在4-42℃的培養(yǎng)液中二周時間，仍能保持活性。

雖然AV和SA在生物學(xué)特性、蛋白質(zhì)亞基組成幾何生物素能力等方面都相似，但兩者不完全相同。AV在體內(nèi)外的非特異性結(jié)合較高，這是因為AV的等電點為10，而SA的只為7：AV含含碳水化合物（甘露糖和乙酰葡糖胺）的量高達10%，這些糖類在體內(nèi)可與組織細胞上的糖受體相結(jié)合，而SA不含糖基。在體內(nèi)標記SA血清除緩慢，而AV血清除較快，但卻易集聚于肝、腎等組織中。這種血清除快慢的差異，可能是因為它們的靜電荷不同。在生理PH下，AV呈強陽電荷，而SA則近中性。總之，SA在體內(nèi)的非特異結(jié)合較AV小，有人認為SA偶和抗體更適合于二步法。

2、BAS系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)程序 BAS預(yù)定位技術(shù)程序，主要分為兩種，即二步法和三步法。

（1）二步法 二步法又分為兩種。第一種方法：靜脈注射AV或SA標記的抗體，或稱AV或SA化的抗體。借助抗原和抗體的特異結(jié)合，一部分AV或SA化的抗體幾何于靶位置。經(jīng)過一定時間，待血中游離的AV或SA化抗體清除體外后，再注射放射核素標記的生物素，借助生物素與AV或SA的高特異結(jié)合，放射性核素集合于靶位置。過一段時間后顯像。注射In-生物素后6個小時，即可或清晰顯像，本底很低。另外有人第一步不是注射AV化或SA化的抗體，而是先注射AV，經(jīng)過24小時候，再注射In標記生物素后10分鐘到2小時，即可全身顯像

二步法的第二種方法：與第一種方法的注射次序相反�？h注射生物素標記的抗體，或稱生速素化抗體，經(jīng)過2-3天，血中游離的生物素化抗體大量減少后，再局部注射放射性核素標記的AV。注射部位主要是腹腔。由于SA等電點較AV低，且不含糖基，本底低，用SA代替AV可獲得更好效果、。有人對8為卵巢癌患者行RII，腹腔注射2mg生物素化抗體，3-5天后腹腔注射500ml In-SA生理鹽水，30分鐘后，即可顯像，癌/非癌組織放射性比值達17±11.

（2）三步法 三步法也分為兩種。第一種方法：先注射生物素抗體；24-48小時候，在注射過量的非標記AV（或稱冷AV），本步目的在于快速清除血中抗體以及使結(jié)合與腫瘤的生物素化抗體結(jié)合上AV；最后注射放射性核素標記的生物素，以便借助生物素和AV的高特異性結(jié)合，使放射性核素結(jié)合于腫瘤部位。前已續(xù)集AV由四個相同的亞基組成，每個亞基可以結(jié)合一個生物素分子，這樣可以多結(jié)合放射性核素，也就是有生物素放大作用。另外，本法也是建立在一下實驗基礎(chǔ)上的，在體內(nèi)，McAb需24-48小時才能在腫瘤部位達到最大聚集，而此時血中的抗體還未完全清除；血中的AV化抗體復(fù)合物很快為肝臟攝取。本法在注射In標記生物素3小時后，即可探測到腫瘤。

三步法的第二種方法：把A蛋白包被的瓊脂糖小珠植于體內(nèi)：再注射AV化的抗體，借助A蛋白與抗體恒定區(qū)片段Fe的特異親和作用，把AV幾何于目標靶。結(jié)果獲得良好的體內(nèi)定位效果。

3.BAS預(yù)定位技術(shù)的優(yōu)點①高靈敏度：生物素標記抗體，不僅對抗體活性影響小，而且可使抗體結(jié)合多個生物素稱為多價制劑。此外，AV或SA具有四個相同亞基，可以同時與多個生物素化抗體即其標記物相連接。這種多價放大作用，使BAS有很多靈敏度：②高特異性：AV與生物素的結(jié)合具有高度特異性，且一旦結(jié)合，很難分解，證實這種高穩(wěn)定度的特異結(jié)合，可減少非特異性結(jié)合：③高穩(wěn)定性：AV與生物素間親和常數(shù)約為抗原與抗體間的1-100萬倍，結(jié)合快，不可逆，對各種試劑的環(huán)境因素不敏感，AV與生物素幾何的符合物很穩(wěn)定：④顯像快：注射放射性核素標記物后數(shù)小時，就可顯像，從而可以使用短半衰期核素：⑤放射性核素標記物在血循環(huán)中滯留時間短，對肝和骨髓損傷�。孩扪�中放射性核素標記物快速清除，可降低本底，提高T/NT比值；⑦不需要用放射性核素直接標記抗體，避免抗體免疫活性受損、

4.RAS預(yù)定位技術(shù)的不足①可能引起免疫反應(yīng)：AV和SA與抗體一樣，均為大分子蛋白質(zhì)，具有免疫原性。另外，BAS預(yù)定位技術(shù)需多次注射毫克級的量，以致病人有可能產(chǎn)生不同形式的免疫反應(yīng)。目前，對此研究尚不充分，例如，還不清楚人抗SA抗體（HASA)或人抗AV抗體（HAVA)對SA或AV的重復(fù)應(yīng)用和預(yù)定位RII是否有不利影響。有報告認為，SA標記抗體的免疫原性較單獨SA或McAb為強。AV或SA引起的免疫反應(yīng)的幾率與把他們引入體內(nèi)的途徑、注入數(shù)量和次數(shù)、腫瘤類型和檢測方法的靈敏度等因素有關(guān)。比較起來，注入體內(nèi)時，SA的免疫原性較AV強。目前，正在研究延緩或封閉其免疫反應(yīng)的方法。寄希望于從組DNA技術(shù)，應(yīng)用基因工程一體蛋白質(zhì)解決這一問題②內(nèi)源性生物素的可能影響：生物素是體內(nèi)廣泛分布的羧化酶的輔酶。一般注射AV化抗體后，約3天左右才能在注射放射性核素標記的生物素，在這段時間內(nèi)與腫瘤結(jié)合的AV化抗體有可能被內(nèi)源性生物素所飽和，而不能在于放射性核素標記的生物素結(jié)合，從實際看，內(nèi)源性生物素的影響似乎不是嚴重的問題。

5.BAS預(yù)定位技術(shù)的研究動向

（1）應(yīng)用AV的“促排”作用 在三步法中，先注射生物素化抗體；在注射AV:最后注射放射性核素標記的生物素。在第二部中，AV的中藥作用之一是加速清除在血中的未被腫瘤結(jié)合的生物素化抗體，這就是“促排”作用。AV追擊生物素化抗體的血清作用迅速，一般5-15分鐘，靶/血比值即提高10倍左右。且AV的促排作用與AV的劑量有關(guān)。AV可應(yīng)用一次，也可重復(fù)應(yīng)用，以進一步降低血本底放射性。在RIT中采用該法，即可減小中藥臟器受輻射損傷程度，又不會降低治療效果。

（2）在兩步法第二種方法中，因為內(nèi)源性生物素和血中生物素化抗體可與放射性核素標記的SA結(jié)合形成復(fù)合物，影響和蘇標記SA在目標靶聚集。為此有人AV促排法也引入二步法中。具體做法如下：靜脈注射生物素化單抗，御鼎衛(wèi)浴結(jié)腸癌，在腹腔注射AV，最后再靜脈注射放射性核素標記的SA。結(jié)果顯示，由于應(yīng)用AV，有效降低了血本底放射性，提高了T/NT比值，又不影響放射性核素標記的SA在目標靶的聚集。在兩步法中，對AV的注射途徑和計量、生物素化單抗計量及與定位時間等均應(yīng)最佳化，一邊獲得最佳效果。

AV或SA的修飾  AV等電點PH約為10，優(yōu)勢一種堿性糖蛋白，在體內(nèi)非特異結(jié)合較高。標記AV注入正常鼠中10分鐘后，肝、腎攝取分別56.6%和28.9%。若將AV的等電點降至7.0-9.3/5.5-6.2/4.0-4.8時，腎臟攝取降低很多，分別降至19.6%、3.1%和1.7%。單肝臟攝取改變不大，這是因為哺乳動物干細胞上有大量的非唾液酸糖蛋白受體，能與末端有半乳糖殘基（Gal)的糖蛋白分子結(jié)合，于是想到若吧Gal連接到SA上，就能把SA-生物素抗體復(fù)合物結(jié)合到肝細胞膜，并進入溶酶體內(nèi)被消化，以加快其血清除速度。AV去糖化還是其賴氨酸殘基乙�；�，呈中性狀態(tài)，可延長其血清除時間。通過對AV和SA修飾，可改進BAS預(yù)定位效果。

（3）放射性核素標記生物素的制備 三步法中的第三部都是注射放射性核素標記生物素或其衍生物。因此第三部用的是通用試劑。高質(zhì)量的通用放射性標記化合物的研制非常重要。生物素不能直接用放射性核素標記，且對標記時的氧化條件要求嚴格。前以蓄積，生物素結(jié)構(gòu)中的咪唑酮環(huán)是與AV結(jié)合的關(guān)鍵部位，標記中必須保持其完整性，生物噻吩環(huán)末端羧基是鏈接外來基團的唯一結(jié)構(gòu)。

(1)碘標記 把生物素偶聯(lián)到已碘化的小分子上，例如，先制備1-間碘苯胺（BIA)，再用混合肝反應(yīng)把I-BIA接到生物素的羧基上。所合成的這種標記生物素，具有完整的咪唑酮環(huán)，與SA結(jié)合良好。本標記法也適用于其他鹵族放射性核素標記生物素。此外，也可先合成生物素酰聚賴氨酸(BIP），這是一小肽類生物素衍生物，再通過這賴氨酸把I標在生物素上，實驗表明小肽類可作為標記生物素的核素載體。

（2）In和Y標記 生物素與金屬配位能力差，中間要通過雙功能配位體乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙烯三胺（DTPA）或它們的衍生物等才能把In和Y標記到生物素上。有實驗表明，用DTPA作配位體的In標記生物素，在正常組織上有非特異性攝取。經(jīng)代謝作用后，游離的In和Y可最終積聚于骨髓。有人研制出一種三價雙功能配位體-去鐵一線脫氨生物素(DACB),這是一種去鐵銨與生物素的衍生物。相比較，去鐵胺與放射性金屬如G和Fe的親和力比轉(zhuǎn)鐵蛋白要高，降低了骨髓攝取。而且，DACB保持了與AV的特一級和能力和在血漿中極好的穩(wěn)定性。

（3）Te標記。經(jīng)過丙二胺虧把Tc標記在生物素上，在腫瘤BAS預(yù)定位RII中獲得良好效果

(4)Cu標記 有人經(jīng)過13N4大環(huán)配體制備出Cu標記生物素偶合物。實驗表明，Cu標記生物素在體內(nèi)很穩(wěn)定，24小時內(nèi)70%ID經(jīng)腎臟排出。

(5）F標記 有人合成了高比活度的F標記生物素衍生物，并成功地在動物模型上進行了二步法預(yù)定位顯像。在加入Cu標記生物素的成功，證明了BAS預(yù)定位技術(shù)可應(yīng)用于PET，這會有效地提高分辨率和靈敏度。

由于McAb分子量大，當應(yīng)用于RII和RIT中時存在許多問題，例如，面議原性較強，容易產(chǎn)生HAMA：在血中清除緩慢,T/NT比值小，難以獲得清晰圖像：分子穿透能力小，不易到達病變部位，不利于顯像和質(zhì)量。所以制備人源抗體和實現(xiàn)抗體小型化成為本領(lǐng)域的兩個核心研究課題。