免疫鑒定法

                                                                                    
免疫鑒定法是利用中藥含有的特異蛋白為抗原制備的特異抗體，與供試品中特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)的一種方法。它是通過(guò)制備特異抗原試劑，采用免疫電泳(immuno—electrophoresis)或瓊脂免疫擴(kuò)散等方法達(dá)到鑒定目的的。本方法具有專(zhuān)屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，適用于中藥的品質(zhì)鑒別。它涉及的相關(guān)技術(shù)主要有血清學(xué)方法、藥理學(xué)方法、受體學(xué)方法、免疫化學(xué)方法、酶聯(lián)免疫法、免疫印跡法等。其中利用中藥含有多糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等具有抗原決定簇的大分子，用它們制成特異性抗體(抗血清)進(jìn)行中藥鑒定，是一種具有高度選擇性的血清學(xué)鑒定方法。血清學(xué)鑒定法可用于來(lái)源科以上到種以下各分類(lèi)等級(jí)的藥用動(dòng)植物分類(lèi)，也可以用于藥用動(dòng)植物的親緣關(guān)系研究。血清學(xué)鑒定特征的研究對(duì)中藥復(fù)方制劑的鑒定具有適用性和重要價(jià)值。血清學(xué)鑒定法中比較重視免疫印跡法(immuno blotting)。該法既可原位轉(zhuǎn)印電泳區(qū)帶，協(xié)助確證中藥特征抗原分布，也可把待鑒別供試品點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，直接進(jìn)行斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(dot—ELISA)鑒別。該方法的缺點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，所需動(dòng)物量大，特異性高的抗體不易制備；免疫血清屬于多克隆抗體，存在交叉反應(yīng)，干燥中藥各種蛋白的降解較難解決。電泳(elctrophoresis，EP)是一種分離和鑒定混合物中帶電離子的技術(shù)，其原理是利用中藥含有蛋白質(zhì)帶電荷的成分，在同一電場(chǎng)作用下，由于各組分所帶電荷的性質(zhì)、電荷數(shù)目以及分子質(zhì)量不同，而泳動(dòng)方向和速度不同，在一定時(shí)間內(nèi)，各成分的泳動(dòng)率不同，結(jié)合譜帶數(shù)和染色不同達(dá)到鑒定的目的。本方法用于含有蛋白質(zhì)、多肽和酶類(lèi)等中藥的鑒定，其特點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好。鑒定對(duì)象多數(shù)為動(dòng)物藥類(lèi)，植物藥的果實(shí)和種子類(lèi)、部分根及根莖類(lèi)中藥，以及含有上述成分的中成藥。常用的方法有SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)聚焦凝膠電泳、不連續(xù)性聚丙烯酰胺凝膠電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、區(qū)帶毛細(xì)管電泳、膠束毛細(xì)管電泳等。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)具有機(jī)械性能好、與被分離物質(zhì)不起反應(yīng)、對(duì)pH值和溫度變化較穩(wěn)定、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。聚丙烯酰胺凝膠電泳是由丙烯酰胺和N，N一亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)但其缺點(diǎn)是標(biāo)記不能用3HzO，而需用3Hz，因此要在真空條件下標(biāo)記，需要一定的條件和設(shè)備。而131I的半衰期較短，因此，在放射免疫分析時(shí)，常用125I來(lái)標(biāo)記抗原。以下僅以125I標(biāo)記抗原進(jìn)行說(shuō)明。放射性碘化標(biāo)記技術(shù)可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是肽、蛋白質(zhì)和酶類(lèi)，可以直接進(jìn)行碘化標(biāo)記，即直接將125I連接到被標(biāo)記分子的酪氨酸殘基上的羥苯基上；另一類(lèi)是甾體類(lèi)化合物、環(huán)核苷酸、前列腺素等小分子化合物，因缺乏可供碘標(biāo)記的部分，多用間接碘化標(biāo)記法，即把碘標(biāo)記后的配位體連接到被標(biāo)記抗原的氨基、羧基和羥苯基上。固相系指預(yù)先將抗體與固體顆�；蚬腆w表面結(jié)合，形成不溶解但仍保持抗體的特異性結(jié)合能力。當(dāng)被測(cè)物、標(biāo)記物的溶劑加至固相抗體中，經(jīng)反應(yīng)后，液相中的標(biāo)記物被結(jié)合到固相支持物上，洗去未結(jié)合的標(biāo)記物，即可將B相和F卡H分離。固相法簡(jiǎn)便、快速，從而已經(jīng)發(fā)展成為了一種固相放射免疫分析方法。反應(yīng)液一每管加入羊抗兔IgG羧化聚苯乙烯乳膠結(jié)合的免疫微球lmL(加前振搖)一37℃水浴15min，離心20min(4000r／min)一立即去除上清液(F相)，測(cè)定沉淀物(B相)5．微孑L薄膜分離微孔薄膜是一種具有一定孑L徑的特殊過(guò)濾膜，直徑0。25mm，微孔直徑≤\0．45肛m，一般多采用孔徑為0．25肛m的。將反應(yīng)后的溶液放入裝有微孔薄濾器上，經(jīng)抽濾后，標(biāo)記物如系小分子化合物，則被濾出，而大分子的復(fù)合物被吸附在微孔薄膜的表面。從而將F相和B相分離。