RNA原理

實(shí)驗(yàn)窄制備單核苷酸一般用化學(xué)水解法(酸、堿水解)和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤堿基；用堿水解可得到2’～核苷酸和3’～核苷酸的混合物(比例2；3)；用5L磷酸二一酯酶或3L磷酸二i酯酶水解則分別可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸本實(shí)驗(yàn)采用堿水解法。一般情況下磷酸二酯鍵對堿是比較穩(wěn)定的，但由于RNA分子中核糖的2’羥基的鄰接基團(tuán)效應(yīng)，使RNA分子中的磷酸二酯鍵變得對堿不穩(wěn)定，因此，RNA可以用堿水解，經(jīng)過2’，3’一環(huán)核苷酸中間物，生成2L核苷酸和3’一核苷黢。堿水解的方法很簡單，一般用0．3N KOH，37℃保溫18小時就能水解完全。水解畢，用高氯酸HCl0。中和，，{三成高氯酸鉀KCl0。沉淀，離心去除沉淀，上清液即為各單核苷酸的混合液。成溶解度較大的高氯酸鈉，使水解液中的鈉離子無法除去。當(dāng)水解液中的單核苷酸與離子交換樹脂上的活性基團(tuán)進(jìn)行交換反應(yīng)時，鈉離子將與單核苷酸起競爭作用，影響單核苷酸交換反應(yīng)的進(jìn)行。而使用氫氧化鉀，則中和水解液時生成的高氯酸鉀溶解度小，產(chǎn)生沉淀，容易離心除去。氫氧化鉀應(yīng)在臨用前配制，因?yàn)闅溲趸�鉀溶液久置會吸收空氣中的二氧化碳生成碳酸鹽。碳酸鹽混入水解液后，在酸性條件下進(jìn)行離予交換層析時會生成二氧化碳，從而在柱中形成氣泡。RNA堿水解液調(diào)至pHl．5上柱，此時，核苷酸的磷酸基團(tuán)因進(jìn)行一級解離而帶負(fù)電荷，二級解離不能進(jìn)行；UMP無NH=基，GMP、CMP和AMP的一NH=基各有不同程度的解離而帶正電荷。各核苷酸所帶凈電荷如下：UMP為一0．75，GMP為0，CMP為+0．16，AM P為+0·19。顯然，UMP因不帶正電荷不與樹脂上陽離子發(fā)生交換而直接流出，GMP凈電荷為0，依靠嘌呤環(huán)與樹脂母體之間的輔助性吸附力吸附于樹脂上，CMP和AMP則因帶正電荷與樹脂上陽離子發(fā)生交換而被吸附，同時也有不同程度的輔助性吸附力存在。洗脫過程中，逐漸升高pIj。在pH2—5之問，由于一NH=解離pK值的不同而使各核苷酸所帶的凈電荷產(chǎn)生明顯差異，同時也由于核苷酸與樹脂之間非極性吸附力存在著差異，因此使各核苷被先后洗脫下來，從而達(dá)到分離的目的。由于各廠家出品的樹脂性能不完全相同，因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際條件選擇不同的洗脫液。本實(shí)驗(yàn)在樣品上柱后，先用pHl．5的HCI溶液洗脫，待UMP全部流出后，再換用pH3．5的HCI(o．0003N)溶液洗脫。根據(jù)備核苷酸所帶凈電荷的差異，洗睨次序應(yīng)為UMP--GMP--AMP--CMP，但由于聚苯乙烯樹脂母體對嘌呤堿的輔助性吸附力大于對嘧啶堿的吸附力，因而使AMP與CMP的洗脫位置互換，實(shí)際洗脫順序?yàn)閡MP—GMP--CMP--AMP若用陰離子交換樹脂分離，可將上柱樣品液調(diào)到pH8，使各核苷酸帶負(fù)電荷而被吸附上柱，洗脫時則逐步降低pH，使各核苷酸分別洗脫下來。DNA對堿穩(wěn)定，一般情況下不被堿水解，對酸不太穩(wěn)定，若用稀酸溫和水解得到的是脫嘌呤酸和嘌呤堿基，用濃酸水解則得到游離堿基。因此，實(shí)驗(yàn)室制備脫氧單核苷酸只能采用酶解法。用5L磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解DNA可分別獲得5’-或3’-脫氧單核苷酸。本實(shí)驗(yàn)用桔青霉5L磷酸二酯酶(即Nuelease PI)水解魚精DNA，得到5L脫氧單核苷酸。該酶的最適pH為4．5—6．0，最適溫度為70℃～80℃，鋅離子有激活作用。以雙鏈DNA作酶反應(yīng)底物時，水解速度極慢，因此，在酶解前必須先將DNA熱變性。該酶制劑中往往混有磷酸單酯酶，它會將5L脫氧單核苷酸水解成無機(jī)磷酸和脫氧核苷，但此酶作用的最適溫度為45℃，因此通過控制酶解溫度就可在一定程度上抑制單酯酶對5’一脫氧單核苷酸的分解，從而得到較多量的51-脫氧核苷酸。10微升微量進(jìn)樣器1支，分析天平，751G型分光光度計(jì)；電熱恒溫水浴鍋}離心沉淀器，
2．  材料
(1)  魚精DNA(上海長陽制藥廠產(chǎn)品，純度約80％<紫
外法>法見附)
 3．  試劑
(1)0．5MpH5．6乙酸鹽緩沖液
(2)0．1MZnCl2
(3)5’一磷酸二酯酶酶液(2000單位／毫升)：稱取酶
(16萬單位／克)12毫克，溶于l毫升0．5MpH5．6乙酸鹽緩
沖液中，置4℃冰箱存放。
 (4)市售粗食鹽
(5)  冰
1．DNA溶液配制t在分析天平上稱取魚精DNA 10毫克，置1．5 X 10厘米小試管中，加入0．8毫升蒸餾水，用玻棒磨片刻后，室溫放置過夜使溶解。
2．DNA熱變性將裝有上述DNA溶液的小試管置lOO℃沸水浴中保溫10分鐘(先保溫1—2分鐘，塞上木塞后繼續(xù)保溫)，取出置千冰一丙酮或鹽冰浴(250毫升燒杯內(nèi)放冰塊，再撒粗鹽若干)中驟冷。
3．酶解 將變性DNA溶液置于70。C恒溫水浴中預(yù)熱2分鐘，加入0．1毫升0．5MpH5．6乙酸鹽緩沖液，10微升0·IMZnCI。溶液和0．1毫升5L磷酸二酯酶酶液(2000單位／毫升)。反應(yīng)系統(tǒng)中各物質(zhì)終濃度為：lOmg／mlDNA，0．05M乙酸鹽緩沖液，0．001MZn”，200單位／毫升酶�；旌暇鶆蚝笥�70。C恒溫水浴中保溫2．5小時。
4．  終止酶解將上述反應(yīng)液從70℃水浴中取出，立即置沸水浴中保溫10分鐘，終止酶反應(yīng)。