蛋白質(zhì)

                                                                                                                                
蛋白質(zhì)是復(fù)雜的有機物，其主要的元素組成為碳，氫、氧、氮、硫。有的還含有磷或金屬元素(如鐵、銅、鋅、鉬等)。各種蛋白質(zhì)的含氮量一般在16％左右，因此通過分析樣品中的含氮量可以測定蛋白質(zhì)的含量。通常，蛋白質(zhì)從組成上可分為簡單蛋白質(zhì)和復(fù)合蛋白質(zhì)兩類。簡單蛋白質(zhì)的基本組成單位是氨基酸，復(fù)合蛋白質(zhì)除基本組成單位氨基酸外，還結(jié)合有其他組分，如核酸、糖類、脂類、磷酸、色素和金屬離子等，它們一般都是與氨基酸的側(cè)鏈基團以共價鍵或配位鍵相結(jié)合。一種有功能的蛋白質(zhì)分子，其特定空間結(jié)構(gòu)的形式實際上是氨基酸單位上各種基團相互作用的結(jié)果，因此，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)化學(xué)，首先要了解氨基酸的性質(zhì)。蛋白質(zhì)在履行各自功能的過程中，必然對其作用對象有特異性的識別能力。例如，酶與底物間、受體與激素間、抗體與抗原間、調(diào)節(jié)蛋白與DNA間都具有典型的分子識別反應(yīng)。分子識別從化學(xué)本質(zhì)上來看，除了雙方在識別部位間有比較強的作用力之外，兩者在空間構(gòu)象上也必須契合，這樣才有利于相互的接近。這種對結(jié)構(gòu)上的嚴(yán)格要求，不僅體現(xiàn)于肽鏈的本身，還往往與肽鏈上存在的糖基密切相關(guān)，使結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系十分復(fù)雜。
    在本節(jié)中，我們將以抗體抗原反應(yīng)為例，從分子水平上來闡明識別的本質(zhì)。同時，以受體與激素等物質(zhì)的作用為例，更多地闡述這種識別過程極其重要的生物學(xué)意義。
    第一節(jié)  組成蛋白質(zhì)的氨基酸(Aid。)丑一(厶G。)H20竺3X10”erg，m01—’27．2kCal，mol叫按AG。二2．303RT·pKa公式計算，該值相當(dāng)于pKa值有5．3的變化，和實驗值相當(dāng)接近。
    對氦基來說，在水中時，其充電自由能的變化為：
    ‘AG。，H20=—N~2廠乙1一亡)b：為質(zhì)子半徑，b：為NH；半徑。氨基在溶劑A及水中充電自由能的變化為：
    (厶G。)+—(AG。)H20：—N~2—(—)1廠—擊)(飛1——飛1)因bI比b2小，在低介電常數(shù)溶劑中，pKa值也應(yīng)有所增加，不過增加十分有限。實際上有時還會略有降低。
    事實上，解離基附近的離子強度對其pKa也有影響。在離子強度為／的溶劑中，在半徑為b的小球上充以ze電荷時，充電自由能的大小為：
    G。=—NZ2ez—(去—了主面)
    k二√、編號N礦；其中，口為小球半徑和離子氛半徑之和，即最接近極限距離，通常設(shè)定d二b+2．5且。k為Boltzman常數(shù)。
    以羧基解離為例，在離子強度J的溶劑中，其自由能的變化為：
    ‘AG。，，-；Ne2—(飛1——i；K面)+；Ne2—(飛1廠—志)與另一離子強度J+溶劑中自由能的變化相比，其差值為：
    ‘AG。，，’—‘AG。，，：；Ne2·(志—…i：品云+志—了品石)很清楚，如果J+>／，(AG。)，’一(AG。)，成為負(fù)值，也就是說，隨著離子強度增加，pKa值減小。
    另外，解離基團的附近如果有電荷存在，也會影響其pKa值。最簡單可以以甘氨酸和丙酸為例，兩者電子排布構(gòu)造相同，但甘氨酸PKa為2．35，而丙酸pKa為4．8l前者羧基解離強于后者300倍，就是由于附近NH亨對質(zhì)子斥力所引起的。蛋白質(zhì)分子上存在著很多電荷基團，相互必然有復(fù)雜的影響。解離基團如果和其他基團形成氫鍵結(jié)合，  pKa值也會有變化。當(dāng)酸式的酸形成氫鍵時，質(zhì)子的釋放受到抑制，pKa增加。共軛堿式的酸作為氫鍵的受體時，其接受質(zhì)子的能力降低，pKa值下減。 用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)，分辨力比鹽析方法高，使用恰當(dāng)時提純效果好。有機溶劑法也廣泛用蛋白質(zhì)制劑的生產(chǎn)上。
    1．  基本原：理    ；    ；
    在等電點附近，蛋白質(zhì)分子主要以偶極離子形式存在。這時如果添加有機溶劑，由于有機溶劑有較低的介電常數(shù)，它使溶液介電常數(shù)減小，增強了偶極離子伺靜電引力，從而使分子集合而沉淀出來。帶電質(zhì)點之間的作用力，根據(jù)庫侖定律，·分別與電荷前乘積成正比，與距離平方成反比，還與介電常數(shù)成反比：
    口一  9lQ2
    ‘——    Era    ·F表示2個帶電質(zhì)點之間的相互作用力，同種電荷為斥力，異種電荷為吸力。9真Q。表示2個帶電質(zhì)點的電荷量。r表示2個帶電質(zhì)點之間的距離。f表示介電常數(shù)。并且規(guī)定以真空為介質(zhì)時的介電常數(shù)為1。常用有機溶劑的介電常數(shù)如下，
    溶  劑    介電常數(shù)    甘氨酸溶液(2．5M)    137    ，    ；另一方面，有機溶劑本身的水合作用會破壞蛋白質(zhì)表面的水合層，也促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而聚集析出。
    在低介電常數(shù)的環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子上基團間的作用力會受到影響，超過限度吼有使蛋白質(zhì)變性之虞。因此，有機溶劑沉淀法一般都須控制在低溫條件下進行。Cohn等曾用添加甘氨酸的辦法，調(diào)節(jié)榕濃中的介電常數(shù)不致過低，創(chuàng)造合適的分離條件。蛋白質(zhì)本身是多價離子，對溶液介電常數(shù)有相當(dāng)貢獻。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度太低時，如添加有機溶劑過度會產(chǎn)生變性現(xiàn)象，這時加入甘氨酸等物質(zhì)，可以避免蛋白質(zhì)變性。
    2．影響沉淀的因素    ：
    (t)pH值  用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)時，如果溶液的pH處在等電點條件下，蛋白質(zhì)的溶解度最低。因此，按各蛋白質(zhì)的等電點來調(diào)節(jié)pH值，有利于它們的分離。
    (2)蛋白質(zhì)濃度  蛋白質(zhì)濃度越高，加入一定量有機溶劑后，蛋白質(zhì)析出越多。另外，蛋白質(zhì)濃度高時，溶液的介電常數(shù)也相應(yīng)提高，可以減少蛋白質(zhì)的變性。不過，如蛋白質(zhì)濃度過高，由于蛋白質(zhì)分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著增強，這樣分離效果變差，：不利于分級沉淀。因此，只有選擇恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度才有可能獲得良好的分離效果。
    (3)離子強度；  中性鹽的加入能促使蛋白質(zhì)在有機溶劑中溶解，并且能防止蛋白質(zhì)的變性。但含鹽過多，卻會使蛋白質(zhì)過度析出，不利于分級沉淀。一般采用0．05M臥下的!稀鹽溶液。    ．