萘醌類化合物的生產(chǎn)工藝（標(biāo)準(zhǔn)品）

萘醌類化合物的生產(chǎn)工藝（標(biāo)準(zhǔn)品）

從化學(xué)結(jié)構(gòu)而言，其他脂類化合物主要有泛醌類的輔酶Q10和萘醌類的紫草素。紫草素具有顯著的抗生育、抗炎、抗腫瘤、殺菌抗病毒、保肝和免疫調(diào)節(jié)等作用。由于紫草野生資源較少，難于人工訓(xùn)話培養(yǎng)，大量采挖勢必造成資源枯竭及生態(tài)環(huán)境的破壞，借助植物細(xì)胞可避免由于過量采伐造成的生態(tài)環(huán)境的破壞。20試劑70-80年代，日本學(xué)者Tabata等最早成功誘導(dǎo)處硬紫草的愈傷組織，并影響紫草寧及其衍生物產(chǎn)量的條件進(jìn)行了研究。80年代后期，我國學(xué)者也對紫草的組織培養(yǎng)進(jìn)行了多方面的研究。目前，紫草素主要通過植物材料提取和組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行工業(yè)化的生產(chǎn)。

愈傷組織誘導(dǎo)

將紫草成熟種子置于含有mol/L 2,4-D和mol/L 激動素的LS瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂1%）上，一直在黑暗、25℃下培養(yǎng)。種子萌發(fā)后于幼根部形成愈傷組織，再將此愈傷組織移植至含mol/L IAA和mol/L激動素LS瓊脂培養(yǎng)基中。

繼代培養(yǎng)

將獲得的1.5g鮮重愈傷組織移入裝有80mL含有mol/L IAA和mol/L激動素LS液體培養(yǎng)基的300mL 三角瓶中，在100r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，使細(xì)胞增殖。培養(yǎng)初起由于瓊脂培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生紫草素易變質(zhì)，細(xì)胞外觀及不均一，但經(jīng)14d培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基后，生長迅速的白色細(xì)胞大量繁殖，以后每隔14d移入新鮮培養(yǎng)基，經(jīng)2-3代培養(yǎng)后，即可獲得均一的細(xì)胞團(tuán)。這樣均一的細(xì)胞團(tuán)經(jīng)14d培養(yǎng)后增加約13倍。細(xì)胞移植時，用不銹鋼制孔徑40um的篩網(wǎng)手機細(xì)胞，按80mL培養(yǎng)基加1.5g鮮重細(xì)胞的比例進(jìn)行接種。

一級培養(yǎng)（細(xì)胞的增殖培養(yǎng)）標(biāo)準(zhǔn)品

接種在LS培養(yǎng)基內(nèi)繼代培養(yǎng)14d后，用如前所述的方法手機細(xì)胞，將1.5g鮮重細(xì)胞接種在80mL IMG-5培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，在細(xì)胞增加6-7倍后，自第10-11天掐對數(shù)增長長期結(jié)束，增殖速度開始降低。生產(chǎn)紫草素的種細(xì)胞的生長階段對第2階段在M-9培養(yǎng)基中的培養(yǎng)有很大影響。用對數(shù)增殖期的細(xì)胞作為種細(xì)胞，紫草素的得率最高。因此，從細(xì)胞收獲量和紫草素生產(chǎn)考慮，在移植后的第9天結(jié)束第1階段最為合適。此外MG-5培養(yǎng)基不含植物激素，所以不能用于維持細(xì)胞株的繼代。

二級培養(yǎng)（生產(chǎn)紫草素的培養(yǎng)）標(biāo)準(zhǔn)品

如前述方法手機以及培養(yǎng)所得細(xì)胞，將2.4g鮮重細(xì)胞移入裝有80mL M-9培養(yǎng)基300mL 三角瓶中，在100r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)。從培養(yǎng)第2天起，一部分細(xì)胞即呈紅色，至第7天全部細(xì)胞完全呈鮮紅色。經(jīng)14d培養(yǎng)的細(xì)胞中紫草素含量為15%，即1L培養(yǎng)基中紫草素的收獲量為15g.

產(chǎn)物的同步提取標(biāo)準(zhǔn)品

在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會將紫草素沖胞內(nèi)分泌到胞外，附著的細(xì)胞壁表面，影響細(xì)胞對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，抑制細(xì)胞生長和紫草素的合成，因此，使用某些有機溶劑在培養(yǎng)過程中同步萃取紫草素，即簡化了次生代謝物的分離提純工作，又降低了產(chǎn)物的反饋抑制。標(biāo)準(zhǔn)品在培養(yǎng)過程中添加維生素C，L-苯丙氨酸和正十六烷聚能提高紫草素產(chǎn)率，其中正十六烷效率最好，提高了5.8倍；加入0.12%的Tween-20.硬紫草細(xì)胞合成色素總產(chǎn)量達(dá)么可干細(xì)胞含18.15mg，比對照提高了4.2倍。另外，在培養(yǎng)過程中加入大孔吸附樹脂吸附紫草色素，可使色素的產(chǎn)量提高6倍。

固定化培養(yǎng)技術(shù)

固定化培養(yǎng)運用于植物細(xì)胞已有幾十年的歷史，由于固定化技術(shù)可以反復(fù)利用細(xì)胞，增加細(xì)胞密度，大幅度提高有效成分的產(chǎn)量，目前，固定化培養(yǎng)議程為利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì)研究的一個重要方向。吧硬紫草細(xì)胞包埋在海藻酸鈣中固定化培養(yǎng)，30d后色素外泌達(dá)70%，而懸浮細(xì)胞僅有30%。如同時使用正十六烷進(jìn)行萃取，色素外泌可達(dá)95%。研究表明固定化培養(yǎng)過程中，45d更換一次培養(yǎng)基，則180d后，細(xì)胞仍有產(chǎn)生色素的能力。