青島捷世康帶您一起做原花青素含量測(cè)定

       1951你那法國(guó)學(xué)者Jacques Masquelier 首次發(fā)現(xiàn)了低聚原花青素具有強(qiáng)的抗氧化性能，是Ve的50倍，Vc的20倍，并且高效、低毒、高生物利用率。由于原花青素顯著的自由基清除能力，抗氧化、清除自由基、抑制脂類過(guò)氧化，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，抑制劑活性，因此具有廣泛的生化和藥理活性，對(duì)近70多種疾病具有直接或間接的預(yù)防治療作用。如預(yù)防、治療心腦序貫疾病，具有抗過(guò)敏及抗炎活性，康致癌劑活性及抗癌作用以及皮膚保健及美容作用，此外，原花青素還有抗真菌，抗致突變活性、抗突變活性、抗輻射作用，抗腹瀉，抗胃潰瘍、抗菌抗病毒、抗齲齒、改善視覺功能、預(yù)防老年性癡呆、治療運(yùn)動(dòng)損傷等功效、所以被廣泛用于食品、飲料化妝品及醫(yī)藥保健等領(lǐng)域。1995年曾被美國(guó)公眾評(píng)價(jià)為最受歡迎的10中植物藥之一。

研究表明、葡萄籽萃取物及其所含有的花青素具有預(yù)防胃潰瘍的生理功能。利用意大利產(chǎn)陳年紅葡萄酒、新釀紅葡萄酒及白葡萄酒為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)果表明以陳年紅葡萄酒的抗氧化效果最佳。其阿紅所含的花青素騎著舉足輕重的作用，別切具有保護(hù)心腦血管、預(yù)防高血壓、抗腫瘤、抗輻射及美容的作用，可作為防癌、抗突變、放置心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無(wú)毒的新型天然抗氧化劑。因而在國(guó)內(nèi)外以葡萄籽提取物中的元花青素為主要活性成分的藥品、食品級(jí)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑以廣泛應(yīng)用，同時(shí)相應(yīng)的單體花色素及其苷作為色素在醫(yī)藥、保健、食品等領(lǐng)域具有廣泛的用途。沖天然資源廢棄物中提取原花青素及其單體花色素是提高產(chǎn)品附加值，資源綜合林勇的重要途徑之一。葡萄籽皮作為葡萄酒及葡萄汁廠的下腳料是綜合利用的中藥資源。其他如山楂、落葉松樹皮、殘次蘋果及皮等也是值得開發(fā)的資源。日美等國(guó)已開發(fā)出多中含有原花青素的蘋果多酚保健品和化妝品。在此過(guò)程中必然涉及原料和產(chǎn)品中原花青素含量的測(cè)定問(wèn)題。

        目前測(cè)定原花青素的方法有很多中，主要有正丁醇-演算法、香草醛-鹽酸法、香草醛-硫酸法、鐵鹽催化比色法、薄層層析法、HPLF、HPLC-MS法等。在上述幾種方法中，比色法測(cè)定具有較大誤差。主要是其他多酚類物質(zhì)的干擾。正丁醇-鹽酸法受原花青素結(jié)構(gòu)的影響較大、兒茶素或表兒茶素及其的具體等都能參加反應(yīng)，測(cè)定的原花青素含量明顯偏高，對(duì)于低聚合度原花青素的測(cè)定并不適宜。正丁醇-鹽酸法測(cè)得的原花青素含量普遍普遍偏低其原因在于該法對(duì)原花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)的依賴性大，兒茶素等單體不反應(yīng)。香草醛-硫酸法由于硫酸的強(qiáng)氧化作用，引起反應(yīng)體系的依賴性大，兒茶素等單體不反應(yīng)。香草醛-硫酸法由于硫酸的強(qiáng)氧化作用，引起反應(yīng)體系放熱、導(dǎo)致原花青素清華分解。也是的測(cè)定結(jié)果偏低。HPLC主要測(cè)定多種聚合度不同的原花青素結(jié)構(gòu)。比較準(zhǔn)確的方法是比色法和HPLC相結(jié)合的方法。葡萄籽提取物多酚類是由原花青素和幾種單體組成的。葡萄籽提取物中中多酚的含量可采用Folin-ciocalteau法測(cè)定，單體的含量采用高效液相測(cè)定。因此葡萄籽提取物中原花青素的含量可由葡萄籽提取物中總多酚的含量減出其中單體含量求得。

        原花青素在酸性條件下，A環(huán)的化學(xué)活性較高，騎上的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發(fā)生縮合、產(chǎn)物在濃酸作用下形成有色的正碳離子。原花青素在熱酸作用下能產(chǎn)生紅色物質(zhì)，并可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于單體原花青素系黃烷-3，4二醇來(lái)說(shuō),C-4位具有極強(qiáng)的親電性，其羥基與C-5，C-7位上的酚羥基組成一個(gè)芐醇系統(tǒng)，是的4位碳易于生產(chǎn)正碳離子。在強(qiáng)酸作用下，正碳離子失去質(zhì)子氧化產(chǎn)生花色素。對(duì)于聚合原花青素其單元見的鏈接鍵易在酸性作用下被打開。和其他方法相比，HPLC法最為精確，既能進(jìn)行提取和分離，又能進(jìn)行鑒定分析，反相的色譜法被證明是分析酚類化合物之有效的技術(shù)，該方法中的液相色譜帶有梯度洗過(guò)裝置，色譜柱主要為方向色譜柱，檢測(cè)器采用紫外或光電二極管檢測(cè)器等。

兒茶素和原花色素的紫外可見光譜在270-280nm間有最大吸收，色譜圖中的紫外可見光譜峰可用于兒茶素和原花色素的檢定。帶有光帶二極管系統(tǒng)檢測(cè)的HPLC適用于上蔟要求，能對(duì)葡萄籽中的分級(jí)分離后的兒茶素和原花色素驚醒快速的分離、鑒定、和定量分析

具體操作如下

一、儀器與試劑

1、儀器 容量瓶、圓底燒瓶、超聲儀、層析缸、紫外分析儀、濾紙、抽濾裝置、燒杯、量筒、硅膠波曾層析板、電熱套、冷凝管、層析柱、751G型在外-可見反光光度計(jì)，旋轉(zhuǎn)薄膜蒸儀等

2、樣品與試劑

1%香草醛甲醇溶液，8%鹽酸甲醇溶液，葡萄籽粉，葡萄梗粉（石油醚脫脂,≤1mm）兒茶素，60%乙醇，乙酸乙酯，濃鹽酸，濃硫酸，正丁醇，硫酸亞鐵銨鹽溶液，甲醇等。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟

1、葡萄籽（梗）提取物的制備

稱取3份石油醚脫脂后的干葡萄籽（梗）峰，沒分2g，分別用60%乙醇以1:7的料液比，在50℃條件下提取3此，洗滌殘?jiān)�，合并提取液及洗滌液，減壓濃縮，加鹽過(guò)濾，用1:3體積的乙酸乙酯萃取3此，減壓濃縮萃取液，得到提取物，定容后備用。

2、改良的香草醛-鹽酸法

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將兒茶素配制成濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/ml的溶液分別取1ml于25ml具塞試管中，加入香草醛鹽酸顯色液5ml，加塞搖勻，30±1℃很溫水浴中避光顯色反應(yīng)30min后，以空白為對(duì)照，在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、樣品測(cè)定 將達(dá)側(cè)樣品配成濃度為0.1mg/ml的溶液，取1ml于25ml具塞試管中，加入6ml40mg/ml的香草醛家村溶液和3ml濃鹽酸，加塞搖勻，在20±1℃的避光環(huán)境下反應(yīng)15H后，一空白對(duì)照在500nm波長(zhǎng)處測(cè)其A值，用兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中花青素的含量。

HPLC法

1、樣品處理 將葡萄籽提取液用適量乙酸乙酯萃取3此，合并萃取液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，殘?jiān)�用少量甲醇溶解，定容�?ml，用HPLC測(cè)定

2、HPLC色譜條件 Exclips XDB C-18 4.6*250mm色譜柱

流動(dòng)相：甲醇：0.1%甲酸水溶液=8：2

流速為1.0ml/min

紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)276nm

個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成20-50mg/L的濃度，根據(jù) 保留時(shí)間判斷葡萄籽中所含花青素的種類，利用峰面積計(jì)算個(gè)中原花青素的含量。