單克隆抗體的制備

單克隆抗體（McAb）要用體外細(xì)胞培養(yǎng)建立永久性產(chǎn)生的抗體的細(xì)胞株的方法制備目前多用人、鼠的致敏B淋巴細(xì)胞與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞（Sp2 O .NS（等）融合。使之在體外無限制生長產(chǎn)生抗體。

首先要用抗原面議動(dòng)物，已得到致敏B淋巴細(xì)胞�；蛘哂扇梭w內(nèi)選取淋巴結(jié)，外周血或病原組織的致敏B細(xì)胞。用這些細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，建立產(chǎn)生McAb的永久性細(xì)胞株。目前雖有用人致敏淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交，建立人-人雜交瘤技術(shù)的報(bào)道，但是很不穩(wěn)定。一般用于面議組織化學(xué)的McAb.基本上都是用小鼠-小鼠雜交瘤制備的。
    免疫動(dòng)物用Balb/c純種小鼠。免疫方法即途徑如前，但多經(jīng)腹腔注射30-50ug可溶性抗原。并與等量完全或不完全佐劑混合。也有人經(jīng)靜脈或脾免疫小鼠。但經(jīng)血路免疫時(shí)應(yīng)注意有發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的危險(xiǎn)。用細(xì)胞免疫時(shí)。細(xì)胞數(shù)以為好。不要低于。經(jīng)一次或二次免疫后，可從眼靜脈放血檢測血清中有無抗體存在，若有可見的瓊脂雙擴(kuò)散效價(jià)，則于最后一次經(jīng)靜脈加強(qiáng)免疫3天后由眼靜脈放血?dú)⑺绖?dòng)物，取脾植被脾細(xì)胞懸液。這時(shí)的脾B細(xì)胞已被激活。病能產(chǎn)生的抗體，是細(xì)胞融合的最佳狀態(tài)。殺死動(dòng)物手機(jī)血清可留作多克隆抗體(PcAt)對照血清。

用作細(xì)胞融合的小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/o細(xì)胞系從小鼠骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的無分泌Ig能力的細(xì)胞系。在融合前，應(yīng)在培養(yǎng)基中加8-氮鳥嘌呤。經(jīng)2-3次代傳，以增加其對選擇培養(yǎng)基中的氨甲喋呤敏感性后才能使用。融合前的Sp 2/O細(xì)胞應(yīng)生長活躍。換液后1-2天，即可長滿培養(yǎng)瓶。沖洗并收集起來經(jīng)過稀釋后。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)細(xì)胞總數(shù)（細(xì)胞總數(shù)為 x 每大格細(xì)胞平均數(shù) x 稀釋倍數(shù) x 體積ml數(shù)）。一邊取一定數(shù)量與脾細(xì)胞融合。脾細(xì)胞來自已免疫的Baib/c小鼠。進(jìn)行融合前將小鼠外部消毒后取脾。放在預(yù)先置好的小杯上的率網(wǎng)上，剪成碎片。并將單純培養(yǎng)液將脾細(xì)胞通過濾網(wǎng)沖入培養(yǎng)基中成為脾細(xì)胞懸液，按上法計(jì)每ml的脾細(xì)胞數(shù)及總數(shù)。

按1：2-1:10的比例混合骨髓瘤細(xì)胞及脾細(xì)胞。離心1000rpm。5分鐘。繼而輕擊管底使細(xì)胞重新懸浮。并將1ml的聚乙二醇在1分鐘內(nèi)緩緩滴加在混合細(xì)胞中，并輕輕用吸管吹打數(shù)次(PEG）是一種促溶劑。能改變細(xì)胞膜促進(jìn)細(xì)胞融合。

放置2分鐘后，加1ml單純培養(yǎng)液。徐徐轉(zhuǎn)動(dòng)試管使均勻混合以終止反應(yīng)。在放置5分鐘。離心去掉上清后，用選擇性培養(yǎng)液（HAT）稀釋之。使每ml中含5x個(gè)細(xì)胞 最后用吸管移入96孔板中，每孔0.2ml。置37℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

經(jīng)融合的細(xì)胞懸液中，有已經(jīng)融合的細(xì)胞，也有沒有融合的細(xì)胞。而融合的細(xì)胞中。有脾細(xì)胞 脾細(xì)胞的融合細(xì)胞。有骨髓瘤-骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞，當(dāng)然也有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的融合細(xì)胞。必須選擇骨髓瘤-脾細(xì)胞的肉能雜交細(xì)胞。

選擇培養(yǎng)的關(guān)鍵是單純培養(yǎng)液中加添HAT選擇培養(yǎng)液。這個(gè)培養(yǎng)液中的H是次黃嘌呤，A是氨甲喋呤 T是胸腺嘧啶核苷 A可以阻斷所有細(xì)胞通過正常途徑合成DNA的途徑，這樣細(xì)胞就會(huì)死亡 幸而培養(yǎng)液中還包括有H及T。假若細(xì)胞中有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT酶），就有可能通過HGPRT酶轉(zhuǎn)化H而合成DNA，若細(xì)胞中還有胸腺嘧啶激酶(TK)酶。它又能利用T來合成DNA（搶救途徑）。而維持細(xì)胞增殖不治死亡。骨髓瘤細(xì)胞缺乏這兩種酶，所以在選擇培養(yǎng)基內(nèi)必然死亡。脾細(xì)胞有這兩種酶。但脾細(xì)胞在培養(yǎng)條件下如無致裂原及其生長因子存在，液無法生長。只有脾細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞。既有這兩種酶又能無限制生長。所以在HAT培養(yǎng)集中得到順利增殖，此即選擇培養(yǎng) 但是，選擇后生長起來的并不是單克隆的。也有可能是多克隆的。所以必須克隆化。建立 真正的但克隆細(xì)胞系。

克隆化就是分離出單個(gè)細(xì)胞。使其通過分裂增殖而獲得一個(gè)遺傳特性十分均一的細(xì)胞全體的全部過程。經(jīng)過數(shù)次克隆化以后，才可能選育出單克隆細(xì)胞系�？寺』�的方法有二。有限稀釋法，即將含有一定數(shù)量的細(xì)胞懸液，經(jīng)過多次倍比稀釋，由1:2/1:4,1:8,1:16,1:32,1:64 直至稀釋到微孔培養(yǎng)板中每孔可能只含一個(gè)細(xì)胞的濃度，放在CO2孵箱內(nèi)是之增殖，這樣可能得到單克隆抗體細(xì)胞系。但是一次克隆化往往不能達(dá)到目的。一般需要重復(fù)三次以上，2、顯微操作法，在顯微鏡下用吸管吸出單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

在克隆化時(shí)，必須進(jìn)行抗體檢測，以確定是否得到了單克隆細(xì)胞系。當(dāng)把一個(gè)產(chǎn)生所需抗體的陽性培養(yǎng)孔中的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋并分別移至96孔板上生長時(shí)，若發(fā)現(xiàn)部分孔培養(yǎng)后細(xì)胞分泌抗體。部分孔不分泌抗體。說明至少還有兩個(gè)克隆的細(xì)胞同時(shí)存在，還需要進(jìn)一步克隆化，若克隆化以后。所有孔都產(chǎn)生同樣抗體，則大致說明可控化已經(jīng)完成。所以克隆化與抗體檢測工作需密切配合。

檢測抗體是鑒定和篩選所需克隆的極重要的一步。目前常用的檢測方法有免疫組織化學(xué)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）以及放射免疫或免疫放射法。檢測方法選擇應(yīng)服從于所制備的單克隆抗體的主要目的和用途，最好將用途與檢測方法結(jié)合，如主要用于免疫組織化學(xué)�？捎胑lisa或放射免疫方法篩選 若所制抗體主要用于ELISA或放射免疫，可用ELISA或放射免疫方法篩選。單克隆抗體十分均一。不同抗體之間理化特性及類別可十分不同，并非每一單克隆抗體都同時(shí)可適用于elisa方式面議及面議組織化學(xué)等-但目前大多數(shù)人喜歡直接用免疫組織化學(xué)方法篩選。這是因?yàn)槊孀h組織化學(xué)方法與其他方法比較不敏感。免疫組織化學(xué)方法能做出者。Elisa及放射免疫往往不成問題。反之，其他方法篩選的抗體，多數(shù)不能進(jìn)行面議組織化學(xué)染色。所以。為了穩(wěn)妥起見。多選用免疫組織化學(xué)方法。常用石蠟包埋的組織篩選。但面議組織化學(xué)篩選的抗體也不一定能作其他用途。

常用的免疫組織化學(xué)方法�？筛鶕�(jù)條件選用固定液。用冰凍切片還是石蠟切片。也因抗原不同而又所選擇。因此，不能只使用一種方法、一種固定液就輕易宣布無所需的陽性克隆存在。同時(shí)抗體檢測常需在短期內(nèi)完成。實(shí)現(xiàn)要充分準(zhǔn)備，以免丟失所需陽性克隆 雖然石蠟切片比冰凍切片檢測的敏感性差，但機(jī)構(gòu)清洗。需注意三方面的問題：1、用保存抗原好的固定劑如：乙醇、甲醇、丙酮、Bouin氏液以及種性緩沖福爾馬林。2、用快速或低溫石蠟包埋。為了快速。就要把組織塊切成2x5 x5mm的小塊。這樣經(jīng)過2-4小時(shí)的固定。透明、包埋及切片即可完成制片工作。為了更好地保存抗原活性采用碳蠟包埋，就更容易篩出抗體。3用敏感簡便的染色方法。如ABC法。有利于檢測培養(yǎng)上清中微量的抗體。

在細(xì)胞融合及克隆化階段，細(xì)胞基本上是微孔培養(yǎng)板上生長。每孔細(xì)胞數(shù)有限。所能產(chǎn)生的抗體量極微。擴(kuò)大培養(yǎng)的方法很多，如用25ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)�？贵w產(chǎn)量就可以擴(kuò)大近100倍。單用500ml及1L的培養(yǎng)瓶時(shí)，培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)液必需不斷轉(zhuǎn)動(dòng)，細(xì)胞才能吸收足夠的CO2與O2，存活良好。這些方法即微管、微球法。都是向工業(yè)化生長過渡的方法。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)最常用的是吧雜交瘤細(xì)胞接種在小鼠腹腔內(nèi)。5天后腹水逐漸增多。其中含抗體濃度很高，去除腹水，就可以得到大量的抗體。

McAb是針對抗原的某一抗原決定簇的,與PcAb針對抗原的許多決定簇不同。他是與抗原的一個(gè)結(jié)合點(diǎn)反應(yīng)，所以是單價(jià)的。而PcAb可與抗原的許多決定簇發(fā)生反應(yīng)�？寺】贵w的分子結(jié)構(gòu)式相當(dāng)一致的，與抗原起反應(yīng)的輕鏈，即可變區(qū)的氨基酸序列比較窄，但比PcAb的反應(yīng)特異。PcAb與抗原結(jié)合點(diǎn)多。結(jié)合力打，所以與抗原的親和力較強(qiáng)。因此，一般PcAb免疫組化染色較強(qiáng)，更加穩(wěn)定不容易洗脫，但往往引起較重的非特異直接面議組織化學(xué)染色的更好的條件。假若進(jìn)行瓊脂雙擴(kuò)散，只有少數(shù)McAb與抗暈?zāi)苄纬煽梢姷某恋砭�。而PcAb與抗原發(fā)生可見的沉淀反應(yīng)。有人認(rèn)為這是因?yàn)镸cAb與抗原結(jié)合的復(fù)合物，在立體結(jié)構(gòu)上簡單化一，不如PcAb與抗原的結(jié)構(gòu)復(fù)雜。用作放免時(shí)，有些McAb不能標(biāo)記。因而就不能再放免法中應(yīng)用。

分泌McAb的細(xì)胞株，一單建立并保持穩(wěn)定，就能源源不斷的大量的常勝質(zhì)地均一、功能相同、不易波動(dòng)的McAb。因而可以寶成使用它的哥哥實(shí)驗(yàn)室都能得出同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也就是容易標(biāo)準(zhǔn)化，使用PcAb則很難做到�，F(xiàn)將McAb與PcAb之間的差別列表如下：