胚胎培養(yǎng)

        
       盡管人類胚胎能在較寬泛的條件下生長發(fā)育，可塑性較大，但研究和實踐證明非最適培養(yǎng)條件會帶來胚胎活性下降甚至喪失的結(jié)果。成功的培養(yǎng)必須有合適的培養(yǎng)液、優(yōu)化的培養(yǎng)系統(tǒng)，才能獲得理想的結(jié)局。

用于培養(yǎng)人類卵細胞與胚胎的培養(yǎng)液有很多種，但其中組成成分大同小異。培養(yǎng)液的基本組成成分有水、電解質(zhì)、能源供體、大分子自蛋白以及附加物質(zhì)，包括維生素、激素及生長因子等。隨著幾年來商業(yè)性培養(yǎng)液的系統(tǒng)化和相對正規(guī)化，越來越多的實驗室采用第一種方式，直接定期購買商品化培養(yǎng)液。

培養(yǎng)液的組成與作用

1、水 水是培養(yǎng)液的主要成分，約占全部組成的99%，稅點額來源和純度是保證培養(yǎng)液質(zhì)量的中藥因素，已有實驗證實，胚胎發(fā)育能力與培養(yǎng)液質(zhì)量呈相關(guān)關(guān)系�？梢再徺I超純水火災(zāi)實驗室制備超純水，蒸餾水制備過程中存在一些干擾物質(zhì)，比如用玻璃蒸餾裝置，可能析出有害的離子，一般蒸餾水還可能含有致熱源，為保證培養(yǎng)液的質(zhì)量，錯采用Millipore-Q水純化系統(tǒng)，在水質(zhì)很差的地方，則宜先用蒸餾法生產(chǎn)初步純化的水源，再經(jīng)Millipore-Q系統(tǒng)處理提供合格的超純水。

實際工作中所有與配置培養(yǎng)液相關(guān)的器皿，如燒瓶，量筒。藥匙，吸管等除符合胚胎培養(yǎng)要求的一次性用品外，都應(yīng)該先用超純水清洗，在經(jīng)過120℃干烤滅菌后方可使用。

自制的超純水需要常規(guī)檢測的主要污染物包括；微生物含量、致熱源、內(nèi)毒素、PH值、電阻、可溶性硅酸鹽及有機污染物。檢測指標包括最大菌株量不超過10個集落形成單位（CFU/ml),最小電阻10mohm/cm，以及內(nèi)毒素水平不超過0.125u/ml。

2、電解質(zhì) IVF培養(yǎng)液的溶質(zhì)構(gòu)架是平衡鹽。典型培養(yǎng)液包括鈉、鉀、氯、鎂及磷酸鹽。因為培養(yǎng)液中美中元素的含量并不多。數(shù)量準確和高純質(zhì)量至關(guān)重要。多數(shù)文獻建議使用分析純或細胞培養(yǎng)級試劑。IVF培養(yǎng)液的電解質(zhì)組成對卵細胞及胚胎細胞內(nèi)的離子水平有重要的影響，從而影響到細胞功能的調(diào)節(jié)。除影響生理功能以外，培養(yǎng)液中的電解質(zhì)，特別是NaCl，是構(gòu)成滲透壓的主要來源，常規(guī)胚胎培養(yǎng)液的滲透壓是275-295mOsmol/L,常規(guī)培養(yǎng)液選擇的范圍為284-286mOsmol/L、

3、能源物質(zhì)——碳水化合物 碳水化合物存在于女性生殖道的體液中，其濃度水平在輸卵管和子宮腔中不同，并且隨著生殖周期的變化而改變。母體基因控制的早期胚胎主要以丙酮酸鹽-乳酸鹽為能量來源，隨著胚胎的發(fā)育，胚胎基因組激活后，則以葡萄糖為主要能量來源。受精液中葡萄糖至少為2.78mmol/lL，以保持精子的活力。

培養(yǎng)液中高濃度的葡萄糖使卵裂期胚胎發(fā)育變慢或發(fā)育阻滯，不過，葡萄糖在磷酸鹽存在時，這種抑制作用可以被氨基酸、EDTA或維生素削減。氨基酸、維生素或EDTA在含葡萄糖和磷酸鹽的培養(yǎng)液中的添加有助于防止呼吸和代謝控制的喪失。胚胎也因此能夠為進一步的發(fā)育保持更加正常的代謝和充分的ATP生產(chǎn)。更值得注意的是致密期后胚胎的培養(yǎng)液中缺乏葡撻唐導致胚胎向囊胚期發(fā)育的能力的受損及活力的喪失。貪睡化合物是著床前胚胎發(fā)育與代謝的主要能源。

IVF培養(yǎng)液中主要含有葡萄糖、丙酮酸和乳酸。除了能源作用以外，葡萄糖還是生物合成的主要前提，而丙酮酸也有抗氧化基的作用。

4、氨基酸 輸卵管和子宮液體含有高濃度的游離氨基酸，卵子和胚胎對氨基酸有特異傳輸系統(tǒng)，并且維持著一個內(nèi)源性氨基酸池。雌性生殖道內(nèi)液體的特征是具有高濃度的丙氨酸、天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽、氨基乙酸、絲氨酸和牛磺酸。除�；撬嵋酝�，輸卵管液中那些高濃度的氨基酸與Eagle`s中的非必需氨基酸的作用極為相似。氨基酸對著床前胚胎有重要的生理作用。1氨基酸是蛋白質(zhì)物質(zhì)生物合成的前體2氨基酸通過轉(zhuǎn)化變成能源分子參與稀薄啊代謝3調(diào)節(jié)細胞能量代謝 4作為溶質(zhì)維持滲透壓平衡5有緩沖能力從而參與維持細胞ph6是細胞內(nèi)抗氧化劑7螯合作用。對多種動物模型包括對人的研究表明，培養(yǎng)液中加入氨基酸有助于胚胎細胞的正�；�因表達。氨基酸已經(jīng)成為IVF培養(yǎng)液的重要組成成分，特別是序貫培養(yǎng)液系統(tǒng)，氨基酸的濃度與種類隨胚胎發(fā)育不同階段而異。

對集中哺乳動物胚胎的研究，如小鼠、大鼠綿陽和牛，都證明培養(yǎng)液含有特異性氨基酸提高胚胎向囊胚期的發(fā)育。非必要氨基酸和谷氨酸鹽提高體外培養(yǎng)鼠胚的卵裂率、囊胚形成率和賦予率，且可減少2細胞器阻滯。

致密期后，非必需氨基酸和谷氨酸鹽促進滋養(yǎng)外胚層的分裂，提高囊胚腔的形成和孵化。必須氨基酸在輸卵管中的濃度很低，表現(xiàn)為減少體外培養(yǎng)胚胎的囊胚細胞數(shù)。這種發(fā)育的抑制可能歸因于第一個4細胞發(fā)育期，組成培養(yǎng)液中一定濃度的必需氨基酸的不良影響。不過必須氨基酸可顯著提高8細胞期后胚胎的分裂率，促進囊胚內(nèi)細胞團的發(fā)育。Bavister等通過研究大鼠胚胎在單一氨基酸中的發(fā)育發(fā)現(xiàn)，按冬氨酸、天冬氨酸鹽、氨基乙酸、組氨酸、絲氨酸和牛磺酸醋精體外培養(yǎng)的大鼠受精卵向囊胚的發(fā)育，而半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸等起抑制作用。所有的一致性氨基酸都存在Eagle`s的必須氨基酸中，而促進大鼠胚胎發(fā)育的氨基酸除了組氨酸都存在Eagle`sa的非必須氨基酸中。

胚胎致密期前使用非必需氨基酸和谷氨酸鹽還可防止胚胎內(nèi)單個細胞結(jié)構(gòu)的過分單一化。在致密化之前，每個細胞與外部培養(yǎng)液直接接觸，而致密期后的胚胎通過轉(zhuǎn)運上皮調(diào)節(jié)器內(nèi)部環(huán)境。此外，以證實致密期轉(zhuǎn)運上皮的形成標識者胚胎對抗酸符合的調(diào)節(jié)能力。除了促進培養(yǎng)陪她的發(fā)育，也有報道證實氨基酸提高幾個五種的體外培養(yǎng)胚胎移植到受體后的活力。

由于氨基酸在溶液中能自發(fā)脫氨基，所以含氨基酸的培養(yǎng)液只能在有限的時間內(nèi)培養(yǎng)以防止銨達到毒性濃度。因此培養(yǎng)液一般37℃培養(yǎng)2-3天。另外，需要注意的是，含有氨基酸的培養(yǎng)液必需保存在2-8℃。

5、大分子蛋白 雌性生殖道中的胚胎暴漏在各種各樣的大分子中，如白蛋白和葡萄糖氨聚糖。胚胎在體內(nèi)為宜沒有接觸過的大分子是血清。以前，常常使用血清與20%氧氣儀器組成一個完整的胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)血清以集中方式損害植入前哺乳動物胚胎的發(fā)育。通過分析小鼠、綿陽和牛的胚胎。發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)液中的血清會改變從受精卵體外培養(yǎng)而來的囊胚的形態(tài)、代謝、基因和超微結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)液中含有血清與囊胚移植后異常大羔的出生相關(guān)。這些數(shù)據(jù)引起廣泛的關(guān)注，通過血清傳遞的這些有害影響的機制認識研究的熱點。不過也有研究認為，綿陽胎兒過大可能與胚胎培養(yǎng)中許晴中氨基酸的濃度有關(guān)。

白蛋白是雌性生殖道含量最豐富的蛋白。配子和胚胎表面的電荷使他們易粘附在玻璃或塑料上，大分子的添加，如血清掰斷白，可防止配子和胚胎的粘附。大分子通過改變表面張力使我們已于對配子和胚胎驚醒操作。次阿瓦，白蛋白可消除毒素的作用維持交替滲透壓，盡管血清白蛋白都是一個相對純化的片段，依然存在脂肪酸和其它小分子的污染，是生物污染的一個坑你的來源。不過，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)重組白蛋白在支持體外受精、體外胚胎發(fā)育及隨后的妊娠上的作用等同于血清白蛋白，且不含感染性蛋白質(zhì)、毒素等，從組人白蛋白添加還可增加胚胎的細胞耐受性。因此充足白蛋白具有關(guān)闊的應(yīng)用前景。、

葡萄糖氨聚糖和蛋白聚糖也是輸卵管和子宮液的主要成分，根據(jù)著床生殖道中透明置酸水平增高的生理現(xiàn)象，可以用葡萄糖氨聚糖透明質(zhì)酸鹽代替許晴添加到培養(yǎng)液中。Gardner等的研究表明，在含有白蛋白的培養(yǎng)液中加入透明質(zhì)酸有意于胚胎發(fā)育病提高胚胎細胞耐凍能力。也有報道認為透明質(zhì)酸有可能有助于某些患者的胚胎著床，從而挑個妊娠率。有研究發(fā)現(xiàn)僅在移植用培養(yǎng)液中添加透明質(zhì)酸鹽，就可增加胚胎的活力。

6、維生素 雖然很多中培養(yǎng)液中含有維生素，其作用還不是很清楚，可能培養(yǎng)液中各種組分之間有相互作用，例如，維生素與氨基酸有協(xié)同作用來防止代謝紊亂。B族維生素是碳水化合物與氨基酸代謝不可缺少的因素。所以，某些維生素可能在胚胎發(fā)育中起重要作用、

7、緩沖系統(tǒng) 絕大多數(shù)培養(yǎng)液利用碳酸氫鹽與二氧化碳緩沖系統(tǒng)來維持生理性PH在7.2-7.4.培養(yǎng)液中的碳酸氫鹽要求二氧化碳培養(yǎng)箱提供5-6%的二氧化碳來維持這個特定的PH。所以碳酸氫鹽/二氧化碳培養(yǎng)箱提供5-6%的二氧化碳來維持這個特定的PH。所以碳酸氫鹽/二氧化碳系統(tǒng)的優(yōu)點就是在這種特此能夠條件下能夠維持胚胎細胞在生理PH范圍內(nèi)。如果改變了條件。暴漏培養(yǎng)液于空氣環(huán)境中，這個系統(tǒng)的不利一面是使培養(yǎng)液的PH快速升高從而可能算還胚胎細胞正常生長發(fā)育。剞劂這個問題的辦法之一是用礦物油覆蓋培養(yǎng)胚胎的培養(yǎng)皿。如果將培養(yǎng)皿拿出培養(yǎng)箱觀察胚胎或進行操作時，油層有助于減慢底層培養(yǎng)液的氣體交換從而延緩PH升高的速度。然而有些操作不適于采用碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)比如取卵、撿卵的過程，以及需要相對長時間在培養(yǎng)箱外操作的時候，比如單精子注射等顯微操作時，就不宜采用碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)。通常解決這個問題的辦法使用HEPES來取代碳酸氫鹽，這樣使培養(yǎng)液在空氣條件下保持PH值的相對穩(wěn)定。