ELISA的操作過程

    ELISA中主要的試劑有抗原（體）、酶標(biāo)抗原或抗體、酶和底物等，抗原和抗體是所有的免疫學(xué)反應(yīng)中都必須具備的。酶標(biāo)抗原或抗體是ELISA的核心試劑，這些試劑可以自己制備也有商品試劑（例如酶標(biāo)二抗）銷售。在自己制備酶標(biāo)物時，除了應(yīng)準(zhǔn)備好純化的抗原和抗體外，還應(yīng)準(zhǔn)備好純化的酶，酶可以從動植物組織或微生物中提取，但過程負(fù)載，而且純度和活性通常很難保證，因此最好從試劑公司公司購買。酶和抗原或抗體鏈接方法的基本原理和酶固定化方法的原理相同，常用的方法包括；以戊二醛為教練劑的戊二醛法和過氧酸鹽為氧化劑的過氧酸氧化法等。ELISA中常用的酶包括辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP),堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase AP)、葡萄糖氧化鎂(Glucose Oxidase GO)、Bβ-D-半乳糖苷酶和脲酶等，其中HRP和AP最為常用。HRP的底物很多，在ELISA中常用是鄰苯二胺與雙氧水、5-氨基水楊酸與雙氧水等；AP常用的底物是對硝基酚磷酸酯和酚酞單磷酸酯等。

ELISA的種類很多，不同ELISA的具體操作過程不完全相同，但是基本過程是一致的。下面以簡潔競爭ELISA測定黃曲霉毒素B1為例，對ELISA的具體操作過程敘述如下。

1、抗原包被（antigen coating)將AFB1與牛許晴白蛋白（BSA)的練街舞AFB1-BSA（也可以是卵清蛋白的練街舞AFB1-OV)溶解于0.1mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液中獎溶液加入酶標(biāo)板的微孔內(nèi)，通常每孔加200ul，4℃放置過夜，去除恢復(fù)至室溫，傾去微孔內(nèi)溶液（包被液），已含有0.05%的TWEEN-20的PH7.0、0.05mol/L磷酸緩沖溶液生理鹽水(PBST)滿孔洗滌3次，每次5min，控干，即得到包被有AFB1-BSA的酶標(biāo)板。在這個過程中AFB1-BSA通過物理吸附包被（粘附）在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上，沒有包被的抗原被洗滌去除。

2、包被抗原的濃度對ELISA的測定結(jié)果由較大的影響，濃度過高或過低都會影響測定結(jié)果，如下圖是不同包被濃度時，競爭ELISA的抑制曲線。在圖中可以看出，包被濃度對靈敏度的影響較大，當(dāng)包被濃度為5ug/ml時，靈敏度（最小檢出量）達(dá)1.57ng/ml,其他濃度的靈敏度都比該濃度的差，這說明5ug/ml是叫合適的包被濃度

從宏觀上看，包被濃度無論是過高還是過低都表現(xiàn)為靈敏度差，但是從微觀上分析，他們的情況是不同的，低包被濃度時，包被抗原的量不足，微孔內(nèi)吸附的抗原量少，可供抗體結(jié)合的抗原決定簇少，從而影響靈敏度高；二高濃度時包被抗原的量過多，微孔內(nèi)吸附的抗原包被抗原進(jìn)一步和抗體結(jié)合，降低了靈敏度，因此只有合適的包被抗原濃度，才能得到最好的靈敏度。這種關(guān)系見下圖

2、封阻 所謂封阻是指酶標(biāo)板被抗原包被后，在微孔中加入一定濃度BSA、OV、明膠或脫脂牛奶等溶液以封阻微孔內(nèi)沒有被抗原包被的空襲，避免抗體非特異性吸附于這些空襲，以提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，常用的封阻劑包括BSA、OV、明膠和脫脂奶等，其中以脫脂牛奶較為便宜，而且封阻效果和其他幾種封阻劑沒有明顯的差別。

3、抗原抗體競爭反應(yīng) 在酶標(biāo)板的每個微孔中加入一定量的適當(dāng)稀釋度的抗體（抗血清），同時分別加入一定量的準(zhǔn)溶液用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線，混勻，37℃保溫1-2H，包被在酶標(biāo)板上的固定抗原（AFB1-BSA)和添加的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品或樣品抽提液中的AFB1游離抗原競爭抗體的結(jié)合位點，PBST洗滌扣干3次，游離的抗原抗體符合無被洗滌去除。

4、酶標(biāo)二抗與抗原抗體復(fù)合物的反應(yīng) 將一定量的適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)二抗溶液加入個反應(yīng)孔，37℃保溫1-2h，酶標(biāo)二抗和抗原抗體符合無反應(yīng)，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物固定在酶標(biāo)板上，PBST洗滌扣干5次，將有力多余的酶標(biāo)二抗去除。

5、底物顯色反應(yīng)和吸光值的測定 每孔加反應(yīng)底物100ul（40mg臨本二胺溶于100ml、PH5.0/0.2mol/L檸檬酸0.1mol/l磷酸氫鈉緩沖溶液，加入150ul H2O2,現(xiàn)配現(xiàn)用，37℃保溫保濕，避光反應(yīng)30min，每孔加50ul 2mol/L,H2SO4終止反應(yīng)，5min后，以酶聯(lián)免疫測定儀于490nm測吸光度。

6、Elisa競爭抑制曲線 以AFB1標(biāo)準(zhǔn)誤溶液中的AFB1的濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以不同AFB1濃度所對應(yīng)的吸光值和AFB1濃度為零時吸光值的比值的百分?jǐn)?shù)（稱為競爭抑制率）為縱坐標(biāo)，繪制ELISA競爭抑制曲線，根據(jù)樣品抽提液的吸光值，利用競爭抑制曲線，計算出樣品中AFB1的含量，上述ELISA的操作過程