巨細胞病毒抗原的制備及在Elisa中的應用

 巨細胞病毒抗原的制備及在Elisa中的應用

巨細胞病毒（CMV)感染能對嬰兒和器官移植手術(shù)后病人造成很大危害，為尋找快速，敏感的檢測方法，及時對感染作出診斷，我們制備出供E.LISA用的CMV凍化及甘氨酸提取抗原。

抗原制備：凍化抗原制備：用AD-169株病毒感染人胚肺二倍體細胞（2BS）株，病變到80%以上時，倒掉細胞維持液，加入一定量PH7.2磷酸緩沖鹽水，反復凍化三次，離心后上清液即為抗原，甘氨酸提取抗原制備：感染細胞方法同上，當病變達80%以上時，倒掉細胞維持液，加入一定量PH7.2磷酸緩沖鹽水，倒點細胞維持液，每克氏瓶加入ph9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖鹽水7.0ml，掛掉細胞，超聲波處理后，3000rpm離心15分鐘，上清液即為試驗用抗原，凍化及甘氨酸提取抗原的對照抗原用同一方法制備，但使用未感染病毒的正常2BS細胞。本實驗的參考抗原為美國產(chǎn)AD-169株凍化抗原3--101J及正常細胞對照抗原3--102.

血清標本：為北京地區(qū)獻血員及孕婦的血清。

ELISA間接法測定血清CMV特異性抗體：凍化和甘氨酸提取及參考抗原30-101J分別用PH9.6的碳酸鹽緩沖液1:50及1:100稀釋，包被40孔聚苯乙烯塑料板（上海市塑料三場），每孔0.1ml，置4℃過夜，三種抗原的正常細胞對照抗原用相同發(fā)發(fā)稀釋及包被塑料板。待檢血清1:50起做4倍稀釋，每個稀釋度許晴分別為加2個抗原及正常細胞對照抗原，實驗操作方法按文獻，結(jié)合物為辣根過氧化酶標記的羊抗人IgG，底物為鄰苯二胺，在492nm讀取OD值，以待血清OD值比陰性對照高2倍的血清稀釋度為重點低度。

CMV凍化及甘氨酸提取抗原用于ELISA法檢測人血清特異性IgG抗體比較：152份健康成人血清隨意分成3組，分別用我們制備的凍化及甘氨酸提取抗原與參考抗原30-101J檢測血清CMV特異性IgG抗體，結(jié)果見表。

三種抗原測定血清CMV特異性IgG抗體結(jié)果

從表可見，凍化及甘氨酸提取抗原與參考抗原3--101J檢測血清，CMB特異性抗體結(jié)果科比。三種抗原同時測定同一地區(qū)相同條件下的人群CMV特異性IgG抗體的陽性率是一致的，凍化抗原為94.4%;甘氨酸提取抗原為91.3%；參考抗原30-101J為94.2%；抗體滴度分布已很一致，抗體滴度介于1:800-1:3200的百分率，凍化抗原為61.1%；甘氨酸提取抗原為56.5%；從圖一可見三種抗原測定血清CMV特異性IgG抗體時，抗體滴度分布是一致的。

由于做補體結(jié)合試驗時，甘氨酸提取抗原的敏感性明顯高于凍化抗原，krishna等。也指出0.1M甘氨酸-NaOH-0.1M NaCL緩沖鹽水提取的抗原測定人許晴CMV特異性IgG和IgM抗體，獲得有意義的結(jié)果�？紤]到同一種抗原用于集中不同實驗中的方便性，我們進一步用甘氨酸提取抗原及參考抗原30-101J在同一試驗條件下，測定55份北京地區(qū)孕婦許晴中CMV特異性IgG抗體，兩種抗原測得的抗體滴度的相關(guān)性結(jié)果見表2

從圖2中可見55份孕婦血清，用2中抗原，同時測定CMV特異性IgG抗體，每份血清抗體的對滴度相當一致。滴度完全一致的有42份，占總血清數(shù)的76.3%；其余13份許晴滴度雖不一致，但相差值一個許晴稀釋度。

我們曾用高速離心方法提純濃縮病毒，這樣制備的抗原用elisa法測定血清CMV特異性抗體時，結(jié)果與參考抗原390-101J一致，但制備抗原需高速離心機等設備，而凍化抗原制備方法簡便，適用于補體結(jié)合試驗及ELISA試驗，則更具有推廣使用價值。