酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（elisa）測(cè)定植物激素含量

 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（elisa）測(cè)定植物激素含量

    在研究植物生命過程中，常常需要準(zhǔn)確了解某一些激素的含量，以及個(gè)激素間的比例，因此，植物內(nèi)源激素的提取、分離、測(cè)定是植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中機(jī)器重要的內(nèi)容。

植物激素（Planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析（RIA)和沒聯(lián)系福面議分析（elisa），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一種類型。在ELISA中，抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)依靠酶標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)，常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標(biāo)記激素分子，成為酶標(biāo)植物激素，稱為酶標(biāo)植物激素，也可標(biāo)記于第二抗體（識(shí)別抗激素抗體Fc片段的抗體獲金黃色葡萄球菌A蛋白），稱為酶標(biāo)二抗。這兩類標(biāo)記物分別用于固相抗體型和固相抗原性ELISA。

A .固相抗原型ELISA；將抗激素的但可控抗體(MAb）與一吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體（RAMIG)結(jié)合，然后加入激素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，時(shí)期與固相化的MAb結(jié)合，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記激素（酶標(biāo)激素）。通過測(cè)定酶標(biāo)激素的被結(jié)合量，可換算除未知樣品中激素的數(shù)量。

B.固相抗原性ELISA；將“激素-蛋白”復(fù)合物（該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白）包被于固相載體，加入待測(cè)激素（樣品或標(biāo)準(zhǔn)品）和抗IAA多克隆抗體（PAb)反應(yīng)，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。然后讓HRP標(biāo)記羊抗兔Ig抗體（HRP-GARIG)與結(jié)合的固相上的PAb反應(yīng)，通過測(cè)定與固相結(jié)合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量。

實(shí)例：

材料：高等植物、真菌、藻類等組織或器官。

儀器：酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、高速冷凍離心機(jī)、恒溫箱、連續(xù)進(jìn)樣器、渦旋儀。96孔微孔板、離心管、研缽、或勻漿器、試管、剪刀、天平（0.0001g）、液氮罐、水浴鍋、氮?dú)庋b置、試管架、橡膠管、注射針頭、C18柱。

試劑：洗滌緩沖液：0.01mol/L PH7.4磷酸緩沖液（PBS),含0.05%Tween-20 、PBS:8.0gNaCl、0.2gNaCl、0.2gKH2PO4、2.96gNa2HPO4·12H2O榮譽(yù)100ml蒸餾水中；

RAMIG溶液或“激素-蛋白”復(fù)合物;

0.1%封閉蛋白（該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白）

抗激素MAb或PAb:

激素標(biāo)準(zhǔn)品木業(yè)及殘幣系類溶液（按雙倍或四倍系列稀釋）；

HRP標(biāo)記激素或HRP-GARIG;

鄰苯二胺（OPD）基質(zhì)液：5mgOPD榮譽(yù)12.5ml 0.01mol/L PH5.0PBS，用前加入30%H2O212.5ul；

3 mol/L H2SO4;

80%甲醇；

樣品稀釋液：100mlPBS溶解0.1g白明膠；

1mmol/L二叔丁基對(duì)苯酚。

過程

（一）激素的提取

快讀稱取新鮮的植物材料0.5000g(若取樣后不能馬上測(cè)定，要用液氮速凍0.5-1h后保存于-40℃冰箱中），將樣品提取液，冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入試管，4℃下提取4小時(shí)，4000rpm離心15min，取上清液，提取兩次那個(gè)合并上清液。上清液C18柱，去除干擾物，在40-45℃水浴下用氮?dú)獯蹈苫蚶鋬龈稍�。用樣品稀釋液定容。渦旋器混勻后用于測(cè)定。

（二）激素的測(cè)定

1、固相抗體型ELISA

 （1）、用方陣法滴定選擇個(gè)反應(yīng)物最適工作濃度；

（2）、將100ul RAMIG溶液包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔，4℃濕盒內(nèi)放置12H

（3）、棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；

（4）、加入100ul抗激素MAb溶液，37℃下放置70min；

（5）棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干

（6）各孔內(nèi)一次計(jì)入50ul待測(cè)樣液，每個(gè)樣品3次重復(fù)，15-20℃下放置20min

（7）計(jì)入5ulHRP標(biāo)記激素，37℃下放置60min；

（8）棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

（9）加入100ulOPD基質(zhì)液，37℃顯色15-20min，加入50ul 3mol/l H2SO4中止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490nm下各孔的A值，求出每份樣品重復(fù)孔的平局值。

（10）用激素標(biāo)準(zhǔn)母液和參比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。

2、固相抗原ELISA

(1)、用主陣法滴定選擇各反應(yīng)物最適工作濃度；

(2)將100ul激素-蛋白復(fù)合物溶液包被于微孔板，37℃下放置12h

(3)、棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；

(4)、加入100ul0.1%封閉蛋白溶液封閉，37℃放置30min。

(5)、棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；

(6)、隔空同時(shí)加入50ul樣液和50ul抗激素PAb溶液，液加入正常兔血清溶液的孔（非特異吸附孔）為空白凋零，37℃下放置60min。

(7)、棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

(8)、加入100ul HRP-GARIG溶液，37℃下放置60min。

(9)、棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；

(10)、隨后的顯色、終止與比色程序同上。

(11)、用激素標(biāo)準(zhǔn)參比溶液，在同一微孔板上同上法操作。、

固相抗體型ELISA結(jié)果計(jì)算：

以加入激素母液的孔（非特異吸附孔）為空白凋零，已加入不含激素的PBS的空為B0孔，以加入激素標(biāo)準(zhǔn)參考系列溶液的隔空為Bi孔。以標(biāo)準(zhǔn)激素摩爾數(shù)的常用對(duì)數(shù)log[激素]為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的IN[B1/(Bo-Bi)]為縱坐標(biāo) ，可得一條Y=a+bX直線。

將樣品孔的A490值帶入上式，換算出待測(cè)樣品中激素摩爾數(shù)量，誠(chéng)意稀釋倍數(shù)，除以樣品重量，即為每克樣品的激素含量。

固相抗原型elisa結(jié)果計(jì)算

以加入不含激素的磷酸緩沖液的孔為Bo孔，以加入激素標(biāo)準(zhǔn)參考系列溶液的各孔為Bi孔。標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算與結(jié)果分析同上。