植物組培技術(shù)

植物的組培技術(shù)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)及科研領(lǐng)域越來越廣泛，他可以對生產(chǎn)脫毒種苗及快速的育種。目前應(yīng)用較為廣泛，組培技術(shù)可以分為普通莖尖培養(yǎng)和莖尖分升組織培養(yǎng)兩種類型。普通莖尖培養(yǎng)是指較大的莖尖（幾毫米乃至幾時(shí)毫米）、牙尖及側(cè)芽的培養(yǎng)，其主要是通過腋芽增殖和反復(fù)繼代培養(yǎng)來獲得大量無性繁殖材料。這種方法技術(shù)簡單，操作方便，易于成活，繁殖速度快，且在繁殖過程中可以保持遺傳的穩(wěn)定性，因而廣泛應(yīng)用于利用常規(guī)方法難以繁殖的蔬菜作物的快速繁殖及種質(zhì)資源的保存。莖尖分生組織培養(yǎng)是指利用位于頂端生長追去錐區(qū)長度不超過0.1mm的莖尖分生組織為外植體的離體培養(yǎng)。研究表明，在莖尖分生組織部位幾乎不存在病毒，因此利用莖尖無病毒區(qū)域驚醒離體培養(yǎng)可以減少乃至消除植物體內(nèi)的病毒，使之恢復(fù)種性，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，目前這種方法在馬鈴薯、大蒜、石刁柏、草石蠶中以得以廣泛應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備：

進(jìn)行精簡培養(yǎng)快速繁殖時(shí)，可從大田種植的蔬菜作物中切取2cm左右的頂芽，進(jìn)行莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)時(shí)實(shí)驗(yàn)材料可小些（1cm左右），側(cè)芽、休眠芽也可作為接種材料。將采到的試材流水沖洗后，用75%乙醇浸30s，再用0.1%氯化汞或其他消毒劑浸泡一定時(shí)間一殺滅試材表面的各種微生物（常用消毒劑及使用效果見表1-1),再用無菌水沖洗3-5次，即可完成消毒過程。如果進(jìn)行普通莖尖培養(yǎng)，外植體一大些為好，一般切取0.5-1cm長的莖尖甚至整個(gè)芽；如驚醒莖尖分升組織脫毒培養(yǎng)，外植體則盡量小些，通常在解剖鏡下剝?nèi)ゼ?xì)葉及葉原基，將生長點(diǎn)暴漏，然后切取0.1-0.2mm長的部分作為培養(yǎng)材料。從去除病毒的角度看，培養(yǎng)材料越小脫毒效果越好，但外植體越小，

培養(yǎng)難度越大，或者時(shí)間越長（有的需要1年甚至更多的時(shí)間），一次應(yīng)綜合兩方面的因素，根據(jù)病毒種類來決定培養(yǎng)材料的大小。

接種于培養(yǎng)

培養(yǎng)材料制備好以后，即可將其接種在培養(yǎng)基上建立起離體培養(yǎng)體系。

莖尖培養(yǎng)多以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，或以此為基礎(chǔ)稍加修改，White、B5等培養(yǎng)基也常用于精簡培養(yǎng)，培養(yǎng)基中通常以蔗糖為碳源，糖濃度一般為3%，濃度過低或過高時(shí)生長受到抑制。培養(yǎng)基中的各種生長調(diào)節(jié)劑是建立培養(yǎng)體系的關(guān)鍵，其中起主要作用的有細(xì)胞分裂素和生長素兩類。細(xì)胞分裂素可促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化，誘導(dǎo)不定芽形成，也有助于結(jié)局頂端優(yōu)勢，促進(jìn)芽萌發(fā)，在莖尖快速繁殖中必不可少。常用的細(xì)胞分裂素有BA(6-芐基腺嘌呤）和激動素（KT)。對于某一些作物，適宜的細(xì)胞分裂素種類及濃度可能有所不同，如阿油菜豌豆，菜心等蔬菜快速繁殖時(shí)，通常用BA,而萵苣則以KT效果為好。近年來研究指出一些新的具細(xì)胞分裂素活性的生長調(diào)節(jié)劑在快速繁殖中也有良好的效果.如TDZ(Thidiazuron,噻重氮苯基脲）具有很高的細(xì)胞分裂素活性，在極低濃度下即可有效的促進(jìn)腋芽增殖。生長素類物質(zhì)如IAA.IBA.NAA.2，4-D等，具有醋精新梢生長的顯著作用，并可誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織和生根。在多數(shù)情況下外緣生長素并非莖尖增殖所必須，但往往濃度的生長素與細(xì)胞分裂素配合可以達(dá)到醋精芽增殖、提高繁殖系數(shù)的效果（Ebida,1993)。不溝通作物中細(xì)胞分裂素與生長素配合的種類和濃度喲所不同，在百合莖尖分升組織培養(yǎng)時(shí)，以MS+BA0.5-1.0mg/L+NAA0.5mg/L效果最佳，而無籽西瓜莖尖快速繁殖時(shí)，MS+BA0.25-0.5mg/L+IAA1mg/L時(shí)芽增殖數(shù)增多，發(fā)芽真長而穩(wěn)定。

莖尖培養(yǎng)中通常加入瓊脂起固化培養(yǎng)基的作用，而Norris在培養(yǎng)馬鈴薯鏡監(jiān)視發(fā)現(xiàn)濾紙橋液體培養(yǎng)能使莖尖生長健壯且發(fā)育早，增殖效果良好。Walket（1980）在橄欖分升組織培養(yǎng)時(shí)也應(yīng)用濾紙橋方法從而使外植體植株可以每周增加3.8倍的速度增殖。此外，在培養(yǎng)基中加入椰乳等天然物質(zhì)，也可以促進(jìn)馬鈴薯、草莓等莖尖的生長和增殖。

接種后經(jīng)培養(yǎng)基置于培養(yǎng)是或培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每日光照12-16h，照度1500-3000lx即可。培養(yǎng)室溫度通常維持在25±2℃，并可以根據(jù)不同植物種類調(diào)整至其生長最適溫度。

莖尖分生組織培養(yǎng)，從培養(yǎng)到植株再生約需6個(gè)月至1年甚至更長時(shí)間，由于培養(yǎng)時(shí)間較長，培養(yǎng)基有時(shí)會失水干燥，因此要定期轉(zhuǎn)移培養(yǎng)體病注意培養(yǎng)基保濕。

生根與移栽

增殖的新稍要經(jīng)過誘導(dǎo)生根階段長出正常根系，才能形成再生植株。一般來講，莖尖外植體在原有的培養(yǎng)基上難以生根，必須轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基。對于大多數(shù)植物，低鹽培養(yǎng)基有利于生根，如果莖芽增殖在全強(qiáng)度MS培養(yǎng)基上進(jìn)行，生根時(shí)鹽濃度應(yīng)減到1/2,或1/4。減少蔗糖濃度（大約1%）和增加光強(qiáng)度（增至（3000-10000lx）也可促進(jìn)根的發(fā)育（Ezura等1993)。有些蔬菜作物的新稍可以再無激素培養(yǎng)基中生根，但對于大多數(shù)蔬菜，誘導(dǎo)生根需要加入適當(dāng)?shù)纳�長素，常用語生根的生長素有IAA、IBA或NAA,其應(yīng)用濃度因蔬菜種類及誘導(dǎo)生根方法不同而異。

當(dāng)新稍長至0.1-1cm高時(shí)，將其切下，出去根部愈傷組織，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，即誘導(dǎo)星峰根系。也有研究指出，將新稍基部在50-100mg/L IBA溶液中處理4-8h，或含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6H后，再將新稍轉(zhuǎn)移至無激素培養(yǎng)基，更有利于幼根的形成和生長。

在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4周，待新稍形成健壯而發(fā)達(dá)的根系后，即可移栽出瓶。移苗前，應(yīng)將培養(yǎng)瓶蓋打開，并向瓶中加入少量水，煉苗1-2d，然后將以生根的小植株小心取出，仔細(xì)洗凈根部培養(yǎng)基，植入裝有滅菌培養(yǎng)基質(zhì)（通常為蛭石與沙）的營養(yǎng)缽中。誒防止移栽后根部雜菌感染，可在移栽前用1%代森鋅浸潤3-5min。移栽后要用玻璃杯或塑料播磨覆蓋，以保證小蜘蛛周圍的相對濕度在90-100%，移栽10d后，可適當(dāng)揭開覆蓋物，逐漸增加氣體交換，直至完全去除覆蓋，小植株即可成活。移栽初期，要用清水澆灌以防因兔絨溶液離子濃度過高造成生理干旱，且應(yīng)給以較低的溫度（16-20℃）和較弱的光照，待小植株有了新的生長時(shí)，在提高移栽成活率。
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