負染的操作及注意事項

 負染的操作及注意事項
    滴染法：一般現(xiàn)將樣品用拉長的毛細吸管一滴在被膜的載網(wǎng)上，用濾紙在載網(wǎng)上吸去多余的樣品，使樣品在載網(wǎng)上僅有一層水膜而無液滴存在。在水膜未干時，再加一滴復(fù)染液在銅網(wǎng)上，然后用濾紙靠在載網(wǎng)變上吸去多余的染液，這是常規(guī)的負染方法。由于病毒在液滴的邊緣分布較多，上訴方法可能造成較多的病毒丟失，改良的方法是用毛細管在載網(wǎng)中部加1-1.5mm直徑的一小滴病毒懸液。不用濾紙吸干而任其在自然狀態(tài)下稍干后加入一小滴染液，也不用濾紙吸干，令其自然趕走。染液的密度取決于液滴的量和它的濃度，應(yīng)經(jīng)試驗確定，此法對于一些濃度低的病毒樣品可能獲得較好的效果。
 
漂浮法：現(xiàn)將需負染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再將有支持膜的載網(wǎng)漂浮在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干樣品余液使樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜，在樣品未干時即加一滴復(fù)染液的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的染液即可。也可在磷鎢酸染液液滴中加入少許提純的病毒混勻，講有膜的銅網(wǎng)漂浮在液面上沾取有病毒的染液，用濾紙靠在銅網(wǎng)吸干。
 
噴霧法：將樣品與染液混合，用特制的噴霧器將混合液噴灑在有膜的載網(wǎng)上。這種方法的優(yōu)點是樣品在載網(wǎng)上的分布十分均勻，但需要特殊的設(shè)備，故較少采用。而且染液和樣品消耗量較大，又易造成病毒的擴散。
負染的時機十分重要，一般不應(yīng)再載網(wǎng)上的樣品完全干了之后，也不應(yīng)該在載網(wǎng)上尚有肉眼可見的水珠時著手染色。應(yīng)該在用濾紙吸干載網(wǎng)上的樣品液滴，肉眼看不見殘液，又未干燥時滴加染液。
提純的病毒在負染時最好進行1:10-1:100倍的稀釋，炫富病毒的緩沖液應(yīng)盡可能稀一些，叫弄的緩沖液會使載網(wǎng)上產(chǎn)生許多鹽類的結(jié)晶而影響圖像的質(zhì)量。緩沖液較濃時，宜先用雙爭輝稀釋。
復(fù)燃用的載網(wǎng)支持膜（有時是碳膜），有時因疏水性的影響沾樣后會形成一個球形液珠，用濾紙一吸即全部吸光，樣品難以附著在支持膜上，遇到這種情況，需要離子濺射儀對載網(wǎng)進行沁水處理，改善支持膜的親水性
復(fù)燃中常遇到顆粒懸滴樣品的凝集現(xiàn)象，即生物樣品與染色劑形成電子致密的團塊，致使無法觀察超微結(jié)構(gòu)。這種現(xiàn)象是由多種因素引起的，除了上訴支持膜疏水性影響外，還可能是懸液濃度過大，懸液中細胞碎片過多，懸液PH值不適等，可以通過對樣品稀釋，驚醒2000-5000rpm離心和調(diào)節(jié)懸液PH值到中興或偏酸性來解決。
懸液顆粒分散性差也可以用分散劑來加以解決
用0.005-0.05%牛血清白蛋白（BSA）加入提純的病毒中，加入量無嚴格規(guī)定，一般0.5ml樣品中加3-4滴即可，如效果不好可適當(dāng)怎額增加，也可直接用0.01%BSA作為離心沉淀物的懸浮液。
將桿菌肽粉末按30-50ug/ml的濃度用蒸餾水配成溶液，用來稀釋離心沉淀的顆粒標本或按適當(dāng)比例加到需負染的樣品中取，也可以按樣品，磷鎢酸和桿菌肽等量混合在滴到載網(wǎng)上，吸干即可觀察。
除上訴兩種分散劑外，還有人采用甘油丙二醇作為分散劑，也有人用1%二甲基亞砜（DMSO）加到染液里加強染液的穿透力和擴散作用，最近有人用十八(碳）烷的單分子層作為濕潤劑，使不易染色的某些生物大恩自以著色。
某些病毒對復(fù)染色液較為敏感，負染色液會破壞形態(tài)結(jié)構(gòu)，遇到這種情況，除改用其它種類的復(fù)染色液之外，還可在負染先用1%的戊二醛按比例與樣品懸液混合，固定15分鐘�；蛘咴谡礃雍�，將載網(wǎng)票在0.1%的戊二醛液滴上進行固定。也可以用四氧化e整齊xun蒸固定然后在做負染。
滴樣后用雙蒸水進行適當(dāng)清洗，可以有效地改善負染效果。尤其是使用醋酸鈾做負染色液時，應(yīng)盡量洗掉樣品中的緩沖液鹽、組織汁液等，以免與負染液反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。經(jīng)固定后的樣品必須經(jīng)過清晰，對直接取自蔗糖密度梯度或氯化銫密度梯度離心沉淀帶的炫富樣品，沾取后雙蒸水適當(dāng)清洗后，就可直接負染觀察。
觀察負染色的生物樣品時，電鏡應(yīng)使用最小的武警光瀾，以增大反差。加速電壓可稍高一些，也增加電子的穿透能力。盡量避免電子束的長時間照射，一般在   3-4萬倍的放大倍率下照像，均可獲得高分辨率的電鏡圖像。