染色方法有哪幾種

染色方法有哪幾種

蛋白質(zhì)-DNA染色法

  試劑  碘化丙啶100ug/ml，FITC  50ug/ml，PBS-EDTA：含EDTA 174mg/ml的PBS。RNA酶1mg/1ml，需加熱至90℃以上30分鐘去除DNA酶。

   操作步驟  取70%冷乙醇固定的細(xì)胞（至少固定12小時(shí)以上）1—2×10⁶/ml，離心，用PBS洗一次，加RNA酶100ul，37℃消化30分鐘。加1ml  PBS-EDTA液，及FITC20ul，混勻，避光，置室溫中5分鐘，加PI 1ml，混勻。避光，置室溫中10分鐘后上機(jī)測定。

吖啶橙（AO）染色法

    注意事項(xiàng)  所用AO必須是Polysciences CO.產(chǎn)品，AO濃度應(yīng)在5—16ug/ml。推薦用以70%冷乙醇固定的小鼠胸腺細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)樣品。以確定不同型號FCM需用的最佳AO濃度。以RNA為橫坐標(biāo)，DNA為縱坐標(biāo)時(shí)最佳圖型應(yīng)呈～型，上、下線應(yīng)平行，不傾斜。凡測試標(biāo)本前先以小鼠胸腺標(biāo)本檢驗(yàn)儀器狀態(tài)。

   AO染液易污染管道，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需用漂白粉或清潔液沖洗管道，再用蒸餾水生理鹽水長時(shí)間沖洗，以使AO染液沖洗凈。

免疫抗體標(biāo)記與DNA雙染色法

    操作步驟  血或骨髓用比重為1.077g/ml淋巴細(xì)胞分層液分離單個(gè)核細(xì)胞。如分層后仍含有較多的紅細(xì)胞，則可用0.83% NH₄CI溶液，以3倍于細(xì)胞懸液量，15℃混勻15分鐘�；蛴谜麴s水溶解30秒鐘后立即加2倍量的1.8%生理鹽水以去除紅細(xì)胞。免疫標(biāo)記的標(biāo)本應(yīng)含90%以上的活細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁷/ml。取50ul細(xì)胞懸液加第一抗體，混勻后置4℃30—60分鐘。用PBS洗細(xì)胞2次。再加第二抗體，混勻后置4℃ 30—60分鐘再用PBS洗細(xì)胞2次，加入約1ml PBS，即可上機(jī)測定�；�?qū)⒓?xì)胞固定于2ml 70%冷乙醇或0.5%多聚甲醛。避光保存于4℃。熒光強(qiáng)度可保持10天不衰老減。標(biāo)記后的新鮮細(xì)胞或固定細(xì)胞均可再用RNA酶100ul（1mg/ml）于37℃中消化30分鐘，加PI 1ml（100ug/ml）混勻，10分鐘后上機(jī)檢測。

DNA與ras基因蛋白檢測法

    取1.5×10⁶細(xì)胞，固定于1ml 100%冷甲醇中，充分振搖后置于—20℃至少10分鐘。離心沉淀，棄上清液。用不含鈣、鎂的HBSS或PBS洗細(xì)胞一次，離心，棄上清液、留約50ul。再加50ul PBS（含1%牛血清白蛋白）及1%羊血清，混合后置室溫中30分鐘。加50ul抗ras MoAb（用含1% BSA的PBS，1：98稀釋）�；靹蚝螅�置冰上30分鐘。用PBS洗兩次。留約50ul上清液，加50ul FITC-兔抗大鼠抗體（該抗體需用PBS作1:10稀釋），混勻后，置冰上30分鐘。用PBS洗兩次，加250ul RNA酶（500u./ml）混勻，置37℃避光保溫30分鐘，再加250ul PI（50ug/ml）混勻，10分鐘后上機(jī)測定�；蚩杉拥谌�抗體，即FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，以增強(qiáng)FITC熒光強(qiáng)度。

PCNA與DNA雙染色法

    1×106細(xì)胞，用1%多聚甲醛及20ug/ml Lysolecithin PBS 1ml固定2分鐘。立即離心沉淀（5000rpm，1分鐘），棄上清液，輕輕振蕩沉淀物。加100%甲醇1ml，置—20℃5分鐘，離心沉淀，棄上清液。加含0.1% NP40的PBS  1ml，混勻，置冰上5分鐘。加第一抗體200ul（PCNA以PBS 1:100稀釋）。對照用Coulter IgG 5ul加PBS 195ul，混勻，置室溫10分鐘。離心沉淀，加第二抗體FITC-羊抗鼠IgG  200ul混勻放置10分鐘。離心沉淀，加PI 500ul（50ul/ml），1000u  RNA酶，混勻后置室溫20分鐘后測定。