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人1α羥化酶（1-Hydroxylase）試劑盒（ELISA）

點擊次數：1108　日期：2018/1/17 14:54:14

人1α羥化酶（1-Hydroxylase）試劑盒（ELISA）

使用說明書

l 本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中人1α羥化酶（1-Hydroxylase）的含量。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人1α羥化酶（1-Hydroxylase）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人1α羥化酶（1-Hydroxylase）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣本處理及要求

1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑和器材

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

名稱	96孔配置	48孔配置	備注
微孔酶標板	8孔×12條	8孔×6條	無
標準品	0.3mL*6管	0.3mL*6管	無
樣本稀釋液	6mL	3mL	無
檢測抗體-HRP	10mL	5mL	無
20×洗滌緩沖液	25mL	15mL	按說明書進行稀釋
底物A	6mL	3mL	無
底物B	6mL	3mL	無
終止液	6mL	3mL	無
封板膜	2張	2張	無
說明書	1份	1份	無
自封袋	1個	1個	無

備注：

1. 標準品濃度依次為：120、60、30、15、7.5、0 U/L

2. 經過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

注意事項

1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9. 不能使用過期產品。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3. 樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算

以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1. 檢測范圍：3.75 U/L – 120 U/L。

2. 靈敏度：最低檢測濃度小于0.1 U/L。

3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4. 重復性：板內變異系數小于10% ，板間變異系數小于15% 。

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