動物、植物、微生物

                                             動物、植物、微生物

乙酰輔酶 A 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于 ATP 合成。此外，乙酰輔酶

A 是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。

測定原理

蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和 NAD 生成草酰乙酸和 NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成速率成正比，340nm 下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶 A 含量的高低。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：液體 10μL×1 支，4℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 22.5mL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑

分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體 30mL×1 瓶，4℃保存。

工作液的配制：臨用前請根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.92 m L），將試劑二、三和四按

照 1:1:90 的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測定 24 樣）；加樣前置 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱 30 min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

乙酰輔酶 A 的提取

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

APX 活性計算公式：

(1) 按樣本蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1μmol AsA 為 1 個酶活單位。

APX(μmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反總×10⁶÷(Cpr×V 樣)÷T

=1.79×△A÷ Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每 g 組織每分鐘氧化 1μmol AsA 為 1 個酶活單位。 APX(μmol/min/g 鮮重 ) = △A÷(ε×d）×V 反總×10⁶÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1.79×△A ÷W

ε：AsA 在 290nm 處摩爾吸光系數(shù)為 2.8×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μL=1×10^-3 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），100μL=0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時間（min），2min。

注意事項：

配制好的試劑二 4℃保存，并且 3 天內(nèi)使用完。

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