酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）雙抗體夾心法檢測(cè)衣原體

機(jī)理
在保持酶分子的催化活性及免疫球蛋白分子（抗體）的免疫活性條件下，將酶分子標(biāo)記與免疫球蛋白分子上，通過已知的表及抗體與待檢抗原特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，在催化酶的底物，使酶底物發(fā)生顏色反應(yīng)，從而驚醒抗原的定量與定性檢測(cè)。

方法

標(biāo)本的采集處理

1、男性尿道標(biāo)本 取材前2小時(shí)內(nèi)不應(yīng)排尿。用細(xì)桿棉簽插入尿道3-4cm旋轉(zhuǎn)并停留數(shù)秒，一去到足夠量的尿道上皮細(xì)胞

2、女性宮頸標(biāo)本 需要用棉簽清潔宮頸口部再換一根插入宮頸口2cm，轉(zhuǎn)動(dòng)并停留數(shù)秒。并注意進(jìn)出時(shí)無碰到陰道壁。為提高效率可宮頸與尿道同時(shí)去測(cè)檢測(cè)。

3、直腸標(biāo)本 將棉簽肛門括約肌，在肛管內(nèi)3cm沿腸壁轉(zhuǎn)動(dòng)并停留數(shù)秒。

取材后，短短棉簽并立即置于衣原體保護(hù)液中，立即送檢或冷凍于-70℃一下待檢。冷凍帶檢標(biāo)本檢測(cè)前置于37℃水浴中迅速振搖融化。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、用已知特異性抗衣原體抗體（一抗）200ul包被酶標(biāo)微量反應(yīng)板，4℃過夜。

2、取出，棄去包被液，每孔加入1%胎牛血清白蛋白200ul，用以封閉微量反應(yīng)板各孔中 的未結(jié)合剩余位點(diǎn)，加蓋密封后放置于37℃孵育30分鐘。

3、取出反應(yīng)板，棄去上清液，用PBS-T磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌三次，每次3-5分鐘甩干。

4、分別加入200ul待檢標(biāo)本混懸液（棉拭子在保存頁中京劇雷震蕩處理后）及陰性對(duì)照、陽性對(duì)照物與微量反應(yīng)各孔中，置于37℃孵育60分鐘

5、洗滌同（3）

6、加已知特異性抗衣原體抗體（二抗）,每孔200ul（與一抗來源相同）,置于37℃孵育60分鐘

7、洗滌

8、加酶標(biāo)記抗IgG抗體每孔200ul，置于37℃孵育30分鐘。一班使用的酶標(biāo)記抗體滴度最好在1:2000以上，滴度太低時(shí)，非特異性反應(yīng)增強(qiáng)，極易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。

9、洗滌

10、加酶相應(yīng)底物，每孔200ul，置37℃或室溫15-30分鐘，一班最為常用的酶及相應(yīng)的底物有兩種：一種為辣根過氧化物酶對(duì)應(yīng)的底物為鄰苯二胺，顯棕黃色：另一種為堿性磷酸酶對(duì)應(yīng)的底物為對(duì)硝基苯磷酸（二鈉）鹽，顯黃綠色。

11、顯色后，立即加終止液終止反應(yīng)，每孔50ul。辣根過氧化酶用2MH2SO4、堿性磷酸酶用3NNaOH為終止液。

12、用酶標(biāo)測(cè)定儀檢測(cè)OD值或直接用肉眼觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷

1、用酶標(biāo)測(cè)定儀檢測(cè)OD值時(shí)

陰性對(duì)照OD值≤0.25

陽性對(duì)照的OD值≥0.50≤2.00

標(biāo)本的陽性結(jié)果：OD＞陽性對(duì)照平均值/2

即陽性對(duì)照平均OD值為一半以上為陽性

測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后1小時(shí)內(nèi)完成
2、用肉眼直接觀察時(shí)，應(yīng)以陰性對(duì)照及陽性對(duì)照物的顏色變化作為參考，被測(cè)標(biāo)本的顏色明顯深于陰性對(duì)照者可以判為陽性。

適應(yīng)證

此實(shí)驗(yàn)為改良的ELISA雙抗體夾心法，可應(yīng)用于人類泌尿生殖道（尿道及宮頸）的粘膜上皮細(xì)胞、尿液及眼結(jié)膜等標(biāo)本中檢測(cè)屬于特異性衣原體脂多糖抗體可檢出10pg/ml抗原成分。靈敏度高，特異性強(qiáng)（敏感性約為75%-95%特異性約為90-98%）,結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且可自動(dòng)操作，廣泛應(yīng)用于標(biāo)本的初篩實(shí)驗(yàn)。