細(xì)胞內(nèi)pH
細(xì)胞內(nèi)pH、膜電位和細(xì)胞內(nèi)鈣都是細(xì)胞激活過程中重要的細(xì)胞參量。實驗表明：外源凝集素刺激淋巴細(xì)胞后幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)pH值的增加。流式細(xì)胞術(shù)多參量（DNA和pH）測量表明，細(xì)胞周期移行過程中，增殖期細(xì)胞比靜止期細(xì)胞更偏堿性。此外，實驗還證明，實體瘤中有一些區(qū)域，它們中的pH值顯著低于正常組織，可能是由于這些細(xì)胞缺氧產(chǎn)生乳酸所造成。
流式細(xì)胞術(shù)中采用的pH熒光探針很多，較常用的有BCECF（2’7’-bis（Carboxyethyl）-5,6-Carboxy Fluorescein，2’7’二羧乙基-5,6羧基熒光素）和6-COFDA（6-Carboxy Fluorescein Diacetate，6-羧基二醋酸酯熒光素），這兩種pH熒光探針都是熒光素的衍生物。還有DCH（2,3-Dicyano-hydrochinone，2,3二氰基氫醌）以及SNARF系列（Seminaphthorhodafluor）和SNAFL系列（Seminaphthof-luorescein）pH指示劑。
BCECF的激光光譜是pH依賴性的，在低pH環(huán)境中激發(fā)峰為450nm，高pH環(huán)境中激發(fā)峰為500nm，其發(fā)射峰對pH不敏感，約為530nm。用BCECF測量細(xì)胞內(nèi)pH采用比例法，即分別用500nm和450nm激發(fā)BCECF所得到的530nm發(fā)射熒光之比。在生理pH有很好的線性關(guān)系，被估計的細(xì)胞內(nèi)pH的最大分辨率為0.4pH單位。用比例熒光測量pH的好處是，測量值不受染料進(jìn)入細(xì)胞多少、細(xì)胞的厚度、光猝滅情況以及染料漏出等影響。試驗中BCECF比例熒光與pH的關(guān)系必須被校準(zhǔn)。作校準(zhǔn)曲線的方法是：將細(xì)胞與已知pH值并加有質(zhì)子載體尼日利亞菌素（nigericin）的緩沖液達(dá)到平衡后，對應(yīng)幾組不同pH值的緩沖液，分別測出熒光發(fā)射的比例，可以獲得pH校準(zhǔn)曲線。質(zhì)子載體的作用是能轉(zhuǎn)運質(zhì)子通過細(xì)胞膜，使膜內(nèi)外pH值相等。此外應(yīng)注意校準(zhǔn)曲線是與測量儀器、所用染料有關(guān)系的，必須嚴(yán)格控制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時和實驗時各種條件的一致性。
BCECF不能直接進(jìn)入細(xì)胞，通過它的乙酰甲酯（aceto-xymethyl ester）BCECF-AM能夠進(jìn)入細(xì)胞中，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解后，釋放出BCECF分子。BCECF在細(xì)胞內(nèi)不進(jìn)入線粒體和其它酸性室如溶酶體，只限于胞漿中，所以測的是細(xì)胞質(zhì)pH。
BCECF對于多數(shù)細(xì)胞滯留性好，不容易從細(xì)胞中漏出來。如果用BCECF-AM標(biāo)記細(xì)胞后，
重新懸浮在緩沖液中，在4℃，兩小時內(nèi)染料仍有95%滯留于細(xì)胞中，所以背景熒光低，信噪比大�？傊捎贐CECF能夠估計將近2單位的pH值，熒光僅限于胞漿內(nèi)并且較穩(wěn)定等特性，使它成為較常用的pH熒光探針。
COFDA的光譜特性與BCECF類似，低pH下激發(fā)峰為450nm，高pH下激發(fā)峰為495nm，發(fā)射峰約為520nm。比例測量是分別以495nm和450nm激發(fā)COFDA所得到的520nm發(fā)射熒光的比例。
COFDA是通過二醋酸酯導(dǎo)入細(xì)胞中，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解后，釋放出羧基熒光素分子，由于它不進(jìn)入線粒體中，所以可以估計細(xì)胞漿pH值，此外COFDA在細(xì)胞內(nèi)滯留特性也較好。
DCH熒光對pH值有很強(qiáng)的依賴性。DCH通過它的酯ADB（1，4-diacetoxy-2,3-dicyano-benzene）進(jìn)入細(xì)胞，然后被酯酶水解成為DCH。DCH在細(xì)胞中的分布，約有10%的染料進(jìn)入細(xì)胞器中。當(dāng)pH為6—7.6時，溶液中的DCH激發(fā)峰為350nm，發(fā)射峰為460nm。比例法測量為：紫外光激發(fā)，測量熒光發(fā)射425/540nm的比例；所得結(jié)果可以估計pH值為6—7.6的范圍，分辨率可達(dá)0.2pH單位。DCH標(biāo)記細(xì)胞后10分鐘，熒光達(dá)到最強(qiáng)，隨后染料逐漸漏失，在4℃染色30分鐘后，約漏掉50%的染料，染色后10—30分鐘內(nèi)，熒光比例是穩(wěn)定的，可進(jìn)行流式測量。
近年來又合成了一些新的細(xì)胞內(nèi)pH熒光探針，例如SNARF和SNAFL系列pH熒光探針，這類探針對于測量6.3—8.6范圍的pH值是很有用的。他們有兩個發(fā)射峰，在酸性溶液中發(fā)黃色或橙色熒光，在堿性溶液中發(fā)紅色熒光。由于其間有一個不依賴于pH值的等發(fā)射點，故可采用以同一激發(fā)波長激發(fā)樣品，測量兩個發(fā)射峰比例的方法。這類探針的另一特點是其吸收光譜也依賴于pH而變化，所以也可采用以兩個激發(fā)波長激發(fā)樣品，測量同一發(fā)射熒光的激發(fā)比例法�？筛鶕�(jù)儀器條件，選擇一種比例法測量細(xì)胞內(nèi)pH值。測量前，必須作pH值與比例值之間的校正曲線。由于這類染料適于較長波長激發(fā)，所以可用氬離子激光器激發(fā)。
SNARF和SNAFL的乙酰甲酯SNARF-AM和SNAFL-AM很容易通過膜進(jìn)入細(xì)胞中，并且比羧基熒光素在細(xì)胞內(nèi)的滯留性能好，是一種很有前途的pH熒光探針。使用時，先以1nM的濃度溶在干燥的DMSO中（放熱防潮），使用前立即用緩沖液稀釋貯液，標(biāo)記細(xì)胞的終濃度為1—5uM。
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