醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白
目的要求
（1）、學(xué)習(xí)醋酸纖維素薄膜電泳原理
（2）、掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白的操作技術(shù)
實(shí)驗(yàn)原理
醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。它具有簡(jiǎn)便、快速、樣品用量少，應(yīng)用范圍廣，分離清晰，沒有吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、同工酶及其他生物大分子的分析檢測(cè)，是醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。
本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有白蛋白、a-球蛋白、B-球蛋白、Y-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。其中白蛋白的泳動(dòng)速度最快，其余依次為a1-、a2-、B-及Y-球蛋白。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可直接進(jìn)行光吸收掃描自動(dòng)繪出區(qū)帶吸收峰及相對(duì)百分比。
試劑和器材
（1）、試劑
巴比妥緩沖液：巴比妥1.66g，巴比妥鈉12.76g，加水至1000mL。置4℃冰箱保存，備用。
染色液：氨基黑10B0.5g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，蒸餾水40mL，混勻。
漂洗液：95%乙醇45mL，冰醋酸5mL，蒸餾水50mL，混勻。
透明液：冰醋酸25mL，無(wú)水乙醇75mL，混勻
（2）、材料
新鮮血清
（3）、器材
醋酸纖維薄膜，培養(yǎng)皿，點(diǎn)樣器，電泳儀，玻璃板，粗濾紙，鉛筆和直尺，竹鑷子
操作方法
（1）、浸泡。用鑷子取醋酸纖維薄膜1張，小心平放在盛有緩沖液的平皿中，浸泡30min左右。
（2）、點(diǎn)樣。將浸透的薄膜從緩沖液取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后平鋪在玻璃板上，使其底邊與模板底邊對(duì)齊。點(diǎn)樣時(shí)，先在點(diǎn)樣器上均勻地沾上血清，再將點(diǎn)樣器輕輕地印在點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1.5cm。
（3）、電泳。根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個(gè)電極槽中，各倒入等體積的電泳緩沖液，在電泳槽的兩個(gè)膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長(zhǎng)邊與支架前沿對(duì)齊，另一端浸入電泳緩沖液中。當(dāng)濾紙全部潤(rùn)濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上，即為濾紙橋。將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（注意：點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽(yáng)極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。通電，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.4～0.6mA/cm膜寬度，電泳時(shí)間約為1～1.5h。
（4）、染色。電泳完畢后將薄膜取下，放在染色液中浸泡10min。
（5）、漂洗。將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫洗。取出薄膜放在濾紙上，用吹風(fēng)機(jī)將薄膜吹干。
（6）、透明。將脫色吹干后的薄膜浸入透明液中，浸泡2～3min后，取出緊貼于潔凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，干后即為透明的薄膜圖譜。
注意事項(xiàng)
（1）、市售醋酸纖維素薄膜均勻干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若漂浮液面的薄膜在15～30s內(nèi)迅速潤(rùn)濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。
（2）、醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，其濃度為0.05～0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快區(qū)帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。
（3）、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴(kuò)散。但不宜太干，否則樣品不易進(jìn)入膜內(nèi)，造成點(diǎn)樣起始點(diǎn)參差不起，影響分離效果。
（4）、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作不要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。
（5）、電泳時(shí)應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為0.4～0.6mA/cm膜寬度，電流強(qiáng)度高，則熱效應(yīng)高；電流過低，則樣品泳動(dòng)速度慢且易擴(kuò)散。
（6）、操作過程為防止指紋污染，應(yīng)戴手套。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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