分光光度法 50 管/48 樣
測定意義：
Pro 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，逆境條件下，植物體內 Pro 含量顯著增 加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸。因此， 脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標之一。
測定原理：
用磺基水楊酸（SA）提取 Pro，加熱處理后，Pro 與酸性茚三酮溶液反應生成紅色；加甲苯 萃取后，在 520nm 測定吸光度。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 玻璃比色皿、冰乙酸 50mL、 甲苯 50mL、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：冰乙酸 25 mL×1 瓶， 4℃保存。（自備） 試劑二：液體 25 mL×1 瓶， 4℃保存。
試劑三：甲苯 50mL×1 瓶，4℃保存。（自備）
樣品測定的準備：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備： 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；之后 置沸水浴振蕩提取 10min；10000g，常溫離心 10min，取上清，冷卻后待測。 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加 入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿；之后置沸水浴振蕩提取 10min；10000g，常溫離心 10min， 取上清，冷卻后待測。
2、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建 議取 0.1mL 血清（漿）加入 1mL 提取液），充分混勻，之后置沸水浴振蕩提取 10 分鐘，10000g， 常溫離心 10 分鐘，取上清，冷卻后待測。
測定步驟：
1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 520nm，蒸餾水調零。 2、樣本測定：
(1)取 0.5mL 樣本+0.5mL 試劑一+0.5mL 試劑二于有蓋試管中，置沸水浴中保溫 30min（蓋
緊，防止水分散失），每 10min 振蕩一次。
(2)待冷卻后，在試管中加入 1mL 試劑三，振蕩 30s，靜置片刻，使色素轉至試劑三中；吸 取 0.8mL-1mL 上層溶液于 1mL 玻璃比色皿中，于 520nm 波長處比色，記錄吸光值 A。
Pro 含量計算：
1、典型回歸方程 y = 0.0521x - 0.0021 (x 為脯氨酸含量，μg/mL；y 為吸光值 A) 2、按照血清（漿）體積計算
Pro 含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021) 3、按照蛋白濃度計算
Pro 含(μg/mgprot)=[(A+0.0021)÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr 4、按照樣本質量計算
Pro 含量(µg/g 重)=[(A+0.0021)÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021)÷W 5、按照細菌或細胞密度計算
Pro 含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021) V1：加入反應體系中樣本體積，0.5mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿） 體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。
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