以DNA和RNA的體外操作為核心而建立的一系列旨在研究基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及其調(diào)控的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及相關(guān)理論，統(tǒng)稱為分子生物學(xué)技術(shù)。其中最突出的是創(chuàng)立于20世紀(jì)70年代的DNA重組技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)已成為人類解碼自身及生物界生命本質(zhì)和主動改變生物遺傳性狀的有力工具，并以此衍生出不少新技術(shù)。
第一節(jié)DNA重組技術(shù)
DNA重組技術(shù)是運(yùn)用多種限制性內(nèi)切酪和DNA連接曲等，在細(xì)胞外將一種外源基因DNA(來自原核或真核生物)和或體DNA入連接重組．形成雜交DNA。再將雜交DNA轉(zhuǎn)入宿主生物(如大腸桿菌)，使外源基因DNA在宿主生物細(xì)胞中隨著生物細(xì)胞的繁殖而增殖或表達(dá)，最終獲得外源基因的表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原省的遺傳性狀。
這項(xiàng)技術(shù)是把DNA作為組件，按生物規(guī)律，人為設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)體外基因的改造，使生物的遺傳性狀獲得改變，故稱為“遺傳工程”(genetic emgomeeomg)。基本質(zhì)是基因的體外重組，所以又稱“基因工程”(gene engineering)或“DNA重組技術(shù)”(recombinant DNA techniques）、“分子克隆”(mo1ecular cloning)等。
第一例DNA重組是1973年加利福尼亞大學(xué)的H.Boyer教授與斯坦福大學(xué)的S.Cohen教授
共同將pSC101質(zhì)粒DNA與另一種抗卡那霉素的質(zhì)粒DNA進(jìn)行體外重組，雜交的DNA轉(zhuǎn)人大腸桿菌，結(jié)果細(xì)菌表達(dá)出了雙親DNA的遺傳信息，即同時(shí)抗四環(huán)索和抗卡那霉親，說明外源基因得到了表達(dá)。DNA重組技術(shù)的成功說明：
①不同來源、無關(guān)的基因在實(shí)驗(yàn)室中可以按人的愿望進(jìn)行重組構(gòu)建。
②重組的外源基因引入另一種生物細(xì)胞后，可以保持其原有的遺傳性狀，在新的環(huán)境中被
增殖、轉(zhuǎn)錄和翻譯，并可使宿注的遺傳性狀按照設(shè)計(jì)的路線發(fā)生永久性的改變。
長期以來，人類在認(rèn)識和改變生物的遺傳特性力面做了大量的研究工作，期待有一天能按人的意愿來改變生物的遺傳性能，獲得預(yù)想的結(jié)果。現(xiàn)在用DNA重組技術(shù)終于實(shí)現(xiàn)了這一意愿。這是20世紀(jì)生命科學(xué)上的重大進(jìn)展．它促進(jìn)了生命科學(xué)理論的發(fā)展，也對改善人類生活做出了重大的貢獻(xiàn)。
這項(xiàng)技術(shù)既運(yùn)用了前人的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括DNA和RNA的分離制備、基因的分離、核
苷酸的順序分析以及分子雜交方法等，同時(shí)也促進(jìn)PCR技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、克隆技術(shù)及以定
點(diǎn)突變技術(shù)為基礎(chǔ)的“蛋白質(zhì)工程”等新技術(shù)的產(chǎn)生。可以說，DNA重組技術(shù)深入到生物科學(xué)
的方方面面，成為當(dāng)今生物科學(xué)工作者必備的基本知識與技能。
一、DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)
DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)不是偶然的，是前人多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)積累的結(jié)果。
1．核酸的制備
20世紀(jì)60年代以來，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括電泳、層析、電鏡、同位素和超離心等技術(shù)及儀器設(shè)備的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，為DNA重組技術(shù)的產(chǎn)生提供了重要的手段。DNA和RNA的分離制備就是一個(gè)例子。20世紀(jì)40年代以前，要想從生活的細(xì)胞中制備出比較完整的DNA和RNA供體外研究是很困難的，因?yàn)槿狈Ρ匾氖侄蝸矸乐笵NA制備過程中脫氧核糖核酸酶(DNase)的陣解作用及操作中剪切力的破壞。在找到檸檬酸、EDTA等金屬絡(luò)合劑和十二烷基硫酸鈉(SDS)、酚、尿素、焦碳酸二乙酪等蛋白變性劑之后，這些試劑有力地抑制了DNase的活力；另
外，低溫高速離心機(jī)以及新的層析方法的運(yùn)用，使制備分子比較完整的DNA成為可能。現(xiàn)在已能從動物組織、植物組織、細(xì)菌及病毒巾制得比較完整的DNA分子。然而，在制備過程中由于操作、振蕩等產(chǎn)生的剪切力對DNA，尤其是高等生物的染色體基因組DNA分子仍有破壞作用，使共總會遭到剪切，故獲得完整的DNA分子仍是不容易的。
RNA的分子比DNA小，極易遭到核糖核酸酶(RNsae)的降解。RNase十分穩(wěn)定，不易被
破壞，且具有驚人的活力，如加熱至蛋白質(zhì)變性的溫度(90℃）其活力也不完全喪失。RNase分布極廣，不僅存在于細(xì)胞內(nèi)也分布在環(huán)境中，包括于和器皿上。如不小心，RNA極易被降解。近年來經(jīng)過技術(shù)改進(jìn)．已經(jīng)能制得各種RNA，尤其是mRNA。
一般講，從細(xì)胞中獲得的DNA、RNA純品，其化學(xué)性質(zhì)是穩(wěn)定的，只要貯存條件得當(dāng)，可以保存很長時(shí)間。這為DNA、RNA在體外進(jìn)行各種研究提供了可能性。
此外，核醒含量的測定、同位素標(biāo)記、分子雜交以及DNA和RNA的核苷酸順序測定等技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展．為在體外分析和鑒定核酸提供了重要的檢測手段。
2．限制性內(nèi)切酶
DNA重組是指在實(shí)驗(yàn)室將兩種DNA分子經(jīng)過切割，選擇適合的片段連接起來的過程。這一步是在限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以后才實(shí)現(xiàn)的。
20世紀(jì)50午代，有人在實(shí)驗(yàn)中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)同一種噬茵體分別與兩種細(xì)鹵培養(yǎng)，噬茵體只在一種細(xì)菌中成活，而杯另一種中絕大多數(shù)不能成活，這表明這個(gè)菌株對入侵的噬菌體具有限制性用。1962年、Arber等人經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)終于證明：細(xì)菌中存在有兩種酶，一種是限制性內(nèi)切酶，可以將外源DNA切割降解；另一種是修飾酶也稱甲基化酶，能使DNA中的核苷酸甲基化，使之不受限制性酶的降解。兩種酶可對同一DNA序列作用。細(xì)菌借助這兩種酶，將自身的DNA進(jìn)行甲基化修飾使之不受限制性內(nèi)切酶的降解，而對外來的、未甲基化的DNA則進(jìn)行降解，以保認(rèn)細(xì)菌自身的DNA不受外來DNA的干擾，保持其遺傳性狀的穩(wěn)定性。這兩種酶在體內(nèi)組成一個(gè)系統(tǒng)，稱限制／修飾系統(tǒng)(restriction-modification system)。
以后從細(xì)菌中分別分離出了I型和II型兩類限制性內(nèi)切酶。I型能識別DNA分子內(nèi)非甲基化的特定序列，但切割是隨機(jī)的．見切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識別位點(diǎn)，不能生成特定片段。II型是1970年Smith第一次從流感嗜血桿菌中分離到的，它能識別雙鏈DNA分子中特定的序列，大部分具有二倍對稱性(回文結(jié)構(gòu))。
對稱軸位于中間AT堿基對之間，箭頭和星號分別表示酶切位置及甲基化位置。II型限制性內(nèi)切酶識別的DNA序列一般長度4、5和6個(gè)堿基對。限制性內(nèi)切酶切割DYA的方式有：
1、從識別序列的中間切開，產(chǎn)生平齊末端(blunt ends)。如HaeIII。
2、在識別序列對稱軸的左邊(3′→5′鏈)和右邊(3′→5′鏈)進(jìn)行切割，形成帶有凸出的；—磷酸苯閉的戳件人端(cohesivend)。
3、介識別序列對稱獨(dú)的右邊(5’一3’鏈)和對稱軸左邊(3’—k5’鏈)切開，形成帶有凸出的3′-羥基的黏性末端(c)。
黏性末端只要用同一個(gè)酶切割的DNA片段退火即可連接，因?yàn)轲ば阅┒嘶パa(bǔ)的。平齊末端則需要另一DNA片段也修飾成平齊末端方可連接。
已知的限制性內(nèi)切酶已達(dá)千余種。在了解各種限制性內(nèi)切酶“切割”特點(diǎn)的基礎(chǔ)上．巧妙利用互相的關(guān)系，即可將DHA分子按人的愿望切剖成人小不同的片段，供DNA重組運(yùn)用。限制性內(nèi)切酶有如一把“生物于術(shù)刀”，為DNA重組技術(shù)提供了有力的工具。
限制性內(nèi)切酶都來自各種細(xì)茵，它們的命名是用細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母〔大寫)和種名的前兩個(gè)字母(小寫)構(gòu)成酶的基本名稱。若酶是從—種特殊菌株來的，在基本名稱后再加上該菌株的名稱符號。名稱后的羅馬數(shù)字，表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。如Hae II是從(H aernophilus aegypticus)中提取的，并且是從中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)酶。
限制性內(nèi)切酶切割成的DNA片段，重組鏈接時(shí)由DNA鏈接酶催化進(jìn)行。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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