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流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展簡史

點擊次數(shù):1405 日期:2016/3/17 13:29:55

  流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, 簡稱FCM)是對細(xì)胞貨細(xì)胞器快讀測量的高技術(shù)。依賴測量的參數(shù),還可以用物理的方法將一個群體中的亞群分選出來,這就是流式細(xì)胞分選術(shù)。上述的“流式”,指的是在測量過程中細(xì)胞是流動的,不是靜止的,這是與在此前對細(xì)胞測量技術(shù)的最大差異之處。流式細(xì)胞書目前在國外的一些有關(guān)實驗室、醫(yī)院已發(fā)展成常規(guī)技術(shù),在我國經(jīng)過十年的推廣也逐漸普及。經(jīng)過數(shù)十年的努力,流式細(xì)胞術(shù)從一個只能計數(shù),稍后可測粒子大小的一起,發(fā)展到今天可快速測定同一個細(xì)胞的多種化學(xué)和物理的特性,這中間凝集這許多人的心血,既有成功也是失敗。
   第一個報道自動計數(shù)細(xì)胞的是Moldavan(1934年),他描述了一個裝置:懸浮的紅細(xì)胞或是用中性紅染色的酵母,在顯微鏡的載物臺上從一個毛細(xì)玻璃管中流過,每個通過的細(xì)胞可別一個光電裝置記錄下來。他注意到了一系列技術(shù)上的細(xì)節(jié)。但此后一直沒有進一步的報道。現(xiàn)在,人們把這個實驗看成是有關(guān)流式細(xì)胞術(shù)的第一個嘗試。1941年,Kie-lland申請了一個專利,大體上與Moldavan差不多,沒有什么更新的內(nèi)容。
通過這些實驗,人們發(fā)現(xiàn),在流式細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞要流過的狹窄管道中存在的最大問題是大細(xì)胞貨細(xì)胞團阻塞通道,為解決這個困境,人們不禁想起1883年和Reynolds用來研究管子中層流時使用的鞘液原理。Guker等人在1947年就是用這個原理個光電技術(shù)結(jié)合起來對氣溶膠中的粒子進行計數(shù)。隨后。Grosland-Taylor利用同一原理在1953年設(shè)計了一個流動室,用光學(xué)方法來計數(shù)血細(xì)胞。他讓懸浮的細(xì)胞慢慢地注入快速流動的液柱中,這個液柱外面被層流鞘液包圍著,粒子在軸心流動。這樣做有兩個好處:一是消除了大個顆粒阻塞現(xiàn)象;二是它可精確控制粒子進入液柱的位置,使之在軸心上,這樣就建立了流體動力聚焦的原理。今天,幾乎所有的流式細(xì)胞術(shù)的液流原理都擦私用了上述技術(shù)。
1949年,Wallance Coulter申請了一個名叫“流動的懸浮粒子技術(shù)方法”的專利,在專利的方法中,他使粒子通過一個小孔。只要粒子與懸浮的介質(zhì)間在電導(dǎo)率上有差異,小孔中粒子的存在與否即能引起可檢測出的電特性變化,此現(xiàn)象通常被稱為Coulter效應(yīng),他在次基礎(chǔ)上生產(chǎn)了Coulter計數(shù)器(1956年)此后還有一些人發(fā)展了各種粒子測量設(shè)備,但原理都差不多。其中Parker和Horst在1953年申請的專利“同時計數(shù)紅白細(xì)胞的方法”,是用稀釋的血細(xì)胞懸浮在等滲液中,白細(xì)胞變成藍(lán)色,紅細(xì)胞認(rèn)為紅色。細(xì)胞通過一根導(dǎo)管再被一束光照射,透射光被分成紅、藍(lán)兩個成分病分別送到光電池上,這樣就可紀(jì)錄通過的細(xì)胞是吸收了藍(lán)光還是紅光。于是不上單紀(jì)錄了通過的細(xì)胞數(shù)目,還識別了通過的細(xì)胞是白細(xì)胞還是紅細(xì)胞,這已經(jīng)有點今日流式細(xì)胞術(shù)的意思了。此后,知道60年代中期,流式細(xì)胞術(shù)始終無多大進展.紅細(xì)胞稀釋液。
1965年,Kamentsky提出兩個新概念:意識用分光光度學(xué)定量測量細(xì)胞組分;另一個是細(xì)胞的不同組分可以被同時多參數(shù)測量,用以給細(xì)胞分類。最初曾用核算的紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同事測量未染色的細(xì)胞,測量的速度大約是每秒測50個細(xì)胞。他同時也是第一個用兩維直方圖顯示并分析多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的人。他也是第一個用計算機接口到儀器上,記錄并分析多參數(shù)數(shù)據(jù)的人。他的這個裝置隨后改裝成商品儀器,商品名為Ortho Cytograph和Cytofluorograph.
1968年,Dittrich和Gohde在英國申請了一個專利,名稱是“在分散體系中自動測量和計數(shù)粒子的裝置”。他們在測量粒子的熒光或磷光時,讓粒子平行于透鏡光軸的方向運動,并通過大數(shù)值孔徑物鏡的焦面,粒子通過焦面后再用一個沖洗液使之偏轉(zhuǎn)。該裝置使用了Kohler照明,因而在粒子運動的出口處可得到均勻的照明,這就免去了聚焦的問題。這樣一個設(shè)備可以用Kohler照明進行熒光的激發(fā),也可以手機發(fā)散的熒光,光源使用氙燈或高壓汞燈。采用大的數(shù)值孔徑透鏡保證了激發(fā)光和收集發(fā)射光都有大的立體角,而較大的立體角又可在測量非對稱細(xì)胞時細(xì)胞不同的取向不致使信號發(fā)生變化。Gohde以很小的變異系數(shù)測量了細(xì)胞群體的DNA。按上述原理制成的商品名稱為Phywe Impulscytophotometer簡稱ICP,隨后生產(chǎn)的ICP22,直到今天還有人仍在使用。
 在1967年,Van Dilla和Los Alamos小組率先發(fā)展了一種液流束、照明光軸,檢測系統(tǒng)光軸三者互相垂直的流式細(xì)胞計。這種不依賴顯微鏡的設(shè)備采用了由Crosland-Taylor設(shè)計的層流流動室并使用氬離子激光器為照明光源。這種垂直相交的系統(tǒng)以后更進一步發(fā)展,除了可測熒光外還可測量散射光,后來還把Coullter計數(shù)器也安裝進去。他們第一個用熒光Feulgen反應(yīng)對細(xì)胞DNA染色,展示了DNA倍性和熒光間的線性關(guān)系,他們的DNA直方圖第一個清楚的顯示出細(xì)胞周期的G1時相、S時相,G2和M時相。他們第一個用同步培養(yǎng)的細(xì)胞論述了定量細(xì)胞動力學(xué),而Gohde和Dittrich則是第一個用流式細(xì)胞術(shù)測量DNA以確定細(xì)胞周期變化來研究藥物影響細(xì)胞周期動力學(xué)的人。
至于歷史細(xì)胞分選術(shù),則首先是由Fulwyler在1965提出的,其改進型是在1969年。他使用了Sweet在1965年使用的一個靜電墨水噴射液偏轉(zhuǎn)技術(shù)。這個技術(shù)原來裝在Coulter計數(shù)器上可使細(xì)胞按體積大小分類。與此同時,也是在1965年,Kamentsky獨立地申請了一個專利,這是一個在液流中經(jīng)過光度學(xué)貨電學(xué)測量后分選細(xì)胞的方法。在此方法中利用了氣體動力學(xué)、水力學(xué)和靜電學(xué)的技術(shù)。后來Friedman曾設(shè)計過一個用液流開關(guān)分選的裝置,但較少使用,直到今天分選用的大部分仍然是電子學(xué)的方法,如Becton Dickinson公司的各種課供使用的FACS儀器仍然在應(yīng)用液滴偏轉(zhuǎn)的原理。
http://www.lilianmeng.com/products/d18.html

原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司

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