枯草芽孢桿菌蛋白酶活力測定

枯草芽孢桿菌蛋白酶活力測定
緩沖液

酶試劑是磷鎢酸和磷鉬酸的混合物，它在堿性條件下極不穩(wěn)定，可被酚類化合物還原產(chǎn)生藍色（鉬藍和塢藍的混合物）。

酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后產(chǎn)生的酪氨酸可與酚試劑反應(yīng)，所生成的藍色化合物可用分光光度法測定。

（1）酚試劑：見實驗1-15Folin試劑乙；（2）0.55mol/L碳酸鈉溶液；（3）10%三氯乙酸溶液溶液；（4）0.5%酪蛋白溶液；稱取酪蛋白2.5g，用0.5mol/L的氫氧化鈉溶液4ml潤濕，加0.02mol/L ph7.5磷酸緩沖液少許，在水浴中加熱溶解。冷卻后，用上述緩沖液定容至500ml。此試劑臨用時配制；（5）0.02mol/L ph7.5磷酸緩沖液；稱取磷酸氫二鈉（NaHPO4·12H2O）71.64g,用水定容至1000ml為A液。稱取磷酸二氫鈉（NaHPO4·2H2O)31.21g,用水定容至1000ml為B液。取A液840ml，B液160ml，混合后即成0.2mol/L（ph7.5）磷酸緩沖液。臨用時稀釋10倍；（6）100ug/mL酪氨酸溶液；精確稱取烘干的酪氨酸100mg，用0.2mol/L鹽酸溶液溶解，定容至100ml，臨用時用水稀釋10倍，在分別配置成集中10-60ug/mL濃度的酪氨酸溶液（7）酶液；稱取1g枯草芽孢桿菌蛋白酶的酶粉，用少量0.02mol/L ph7.5的磷酸緩沖液溶解，然后用同一緩沖液定容至100ml。震搖約15min，時期充分溶解，然后用干紗布過濾。吸取濾液5ml，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)（如20/30或40倍）供測定用。此酶液可在冰箱中保存一周。

操作

1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取不同濃度（10-60ug/mL)的酪氨酸溶液各1ml，分別加入0.55mol/l碳酸鈉溶液5ml，酚試劑1ml。置30℃恒溫水浴中顯色15min，用空白管（只加水，碳酸鈉溶液和酚試劑）做對照測定A680,以A680為縱坐標(biāo)，酪氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、酶活力測定

吸取0.5%酪蛋白溶液2ml置于試管中，在30℃水浴中預(yù)熱5min后加入預(yù)熱（30℃ 5min）的酶液1ml，立即計時。反應(yīng)10min后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3ml，放置15min后，用濾紙過濾。

同時另作一對照管，即取酶液1ml先加入3ml10%的三氯乙酸溶液，再加入0.55mol/L的碳酸鈉溶液5ml，混勻后再個加入酚試劑1ml，立即混勻30℃顯色15min。以加水的一管做空白，側(cè)對照及樣品的A680.

計算

規(guī)定在30℃、ph7.5的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生酪氨酸1ug為一個活力單位，則1g枯草芽孢桿菌蛋白酶在30℃，PH7.5的條件下所具有的活力單位為；

(A樣-A對）·K·N

式中A樣；樣品液的A680; A對；對照液的A680; K；標(biāo)準(zhǔn)曲線上A680為1時的酪氨酸微克數(shù)；t；酶促反應(yīng)的時間（min），本實驗 V:酶促反應(yīng)管總體積（ml），本實驗V=6； N:酶液的稀釋倍數(shù)，本實驗N=2000.

原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司