白藜蘆醇制備方式
白藜蘆醇，化學(xué)名稱3,5,4-三羥基-1,2-二苯基乙烯，又名3,5,4-三羥基芪，有順式與反式兩種構(gòu)型，反式為其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而且生物活性更加廣泛，分子式為C14H12O3，相對(duì)分子質(zhì)量為228.25，為白色結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)為253-255℃溶解于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿。 白藜蘆醇主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑葚、松樹、買麻藤、朝鮮槐等12科、31個(gè)屬的72中植物中，白藜蘆醇藥理作用主要包括抗癌作用，心血管保護(hù)作用，抗氧化、抗自由基、神經(jīng)保護(hù)作用、抗炎作用、抗菌、抗真菌作用、機(jī)體損傷的保護(hù)作用、植物雌激素作用，對(duì)骨代謝和內(nèi)皮素拮抗劑的影響等。
白藜蘆醇的主要獲得途徑有三條；1 從天然藥物中提取精制，主要一含量相對(duì)較高的虎杖和葡萄皮為原料，采用有機(jī)溶劑提取、高效液相色譜、硅膠柱層析或大孔吸附樹脂吸附分離的方法來提純虎杖中的白藜蘆醇得到了較好的效果。2 化學(xué)合成法，李曉光采用三步反應(yīng)及分離提純，得到了純度 98%的白藜蘆醇；3 采用生物技術(shù)制備，目前，生物技術(shù)制備白藜蘆醇方法主要有生物合成和微生物生物轉(zhuǎn)化法等
白藜蘆醇源于桂皮酸途徑生成的4-香豆酰輔酶A。4-香豆酰輔酶A與丙二酸單酰輔酶A縮合，失去一分子CO2生成diketide; diketide與丙二酸單酰輔酶A縮合，失去一分子CO2生產(chǎn)triketide; triketide與丙二酸單酰輔酶A縮合，失去一分子CO2生成tetraketide; tetraketide在白藜蘆醇合成酶作用下環(huán)合，并失去一分子CO2生成白藜蘆醇。此外tetraketide在查爾酮合成酶作用下可環(huán)合生成查爾酮，從而衍生得到黃酮類化合物。
利用土壤桿菌轉(zhuǎn)化葡萄細(xì)胞生產(chǎn)白藜蘆醇
葡萄果皮愈傷組織與培養(yǎng)3D，期間用4.0mol/ l的甘露醇處理六小時(shí)，浸染時(shí)間20min，浸染溫度24℃，共培養(yǎng)36小時(shí)；抑菌抗生素用500mg/L頭孢噻虧鈉，以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，可使轉(zhuǎn)化率達(dá)78%做喲。經(jīng)過高壓紙電泳實(shí)驗(yàn)證明MO能合成冠瘦堿，說明T-RNA已經(jīng)整合到葡萄細(xì)胞核基因上并表達(dá)。對(duì)MO進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)它生長(zhǎng)迅速。生物量提高20%-30%用He-Ne激光器對(duì)MO進(jìn)行輻射12min時(shí)獲得突變細(xì)胞株T12，對(duì)T12進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)他的生長(zhǎng)周期比對(duì)照前提前8H左右，同時(shí)白藜蘆醇的合成量提高至對(duì)照的1.5-1.8倍�；瘜W(xué)誘導(dǎo)子或是真菌誘導(dǎo)子都對(duì)白藜蘆醇有促進(jìn)作用，當(dāng)在細(xì)胞生長(zhǎng)的第30天左右加入ALCL3(7.5mg/L)+灰色葡萄胞（10mg/L)誘導(dǎo)子時(shí)，可使白藜蘆醇的產(chǎn)量在細(xì)胞本身生長(zhǎng)不受影響的條件下增加400-500%
芪合成酶基因轉(zhuǎn)化番茄產(chǎn)生白藜蘆醇
白藜蘆醇合成酶是白藜蘆醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，它以4-香豆酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A為底物催化合成白藜蘆醇
譚林在芪合酶基因轉(zhuǎn)化番茄產(chǎn)生白藜蘆醇的研究中，采用通過PCR擴(kuò)增和克隆，獲得了來自葡萄品種雷司令和粉紅玫瑰葉片中芪合成酶基因，并進(jìn)行了全系列分析。其次對(duì)芪合成酶基因制備表達(dá)載體的構(gòu)建；用BamH I和Sac I同時(shí)酶切pS2、pS1以及pBI121、P EV2，使得 S2、S1分別插入替代pBI121;pEV2中的 GUS金銀，構(gòu)建成植物表達(dá)載體PBS2、PCV2S1,PBS2中含CaMv35s組成型啟動(dòng)子，使S2基因能在番茄植株的各個(gè)部位表達(dá)PEC2S1則含有果實(shí)特異性啟動(dòng)子TFP2,使S1基因只能在番茄果實(shí)中表達(dá)。經(jīng)雙酶切鑒定，證實(shí)S2 S1基因已插入。將pbs2和pev2s1通過三秦交配法導(dǎo)入土壤桿菌，經(jīng)過PCR鑒定證實(shí)pbs2和pev2s1已導(dǎo)入土壤桿菌 LBA4404浸染2-3min后子夜葉盤在含50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上的處愈率和分化率最佳。通過卡那霉素生根篩選，獲得轉(zhuǎn)芪合酶基因的番茄TX0014品種5株，提取這五株轉(zhuǎn)基因植株和一株對(duì)照植株的總 DNA，做PCR檢測(cè)，5株均呈陽(yáng)性，二隊(duì)找植株無特異片段出現(xiàn)，氣候進(jìn)行Southern雜交分析檢測(cè)，結(jié)果表明，芪合成酶金銀以整合到其中3株的基因組中，最后再用HPLC法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)白藜蘆醇的含量；其含量分別為12.45mg/kg5.35mg/kg4.35mg/kg，而對(duì)對(duì)照植株未檢出這表明芪合成酶基因已在轉(zhuǎn)基因番茄中表達(dá)。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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