PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)的問題及解決辦法

       ③加入的人工合成引物是否爭(zhēng)取。

       ④在未加入Taq DNA聚合酶之前，將反映系統(tǒng)放置在95℃保溫5-10分鐘，以使蛋

         白酶及核酸酶失去活性

2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳中呈片狀。

   ①減少Taq DNA聚合酶的濃度。

   ②增加退火的溫度

   ③降低Mg++的濃度。

   ④減少擴(kuò)增循環(huán)周期次數(shù)。

   ⑤減少退火及延伸的時(shí)間。

   ⑥從凝膠中回收與所希望的DNA片段大小相同的DNA,再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3、凝膠電泳中出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶

   ①檢查引物的3`-端是否互補(bǔ)。

   ②設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的引物。

   ③增加靶目標(biāo)DNA的量。

   ④降低引物的濃度。

   ⑤減少擴(kuò)增循環(huán)周期次。

   ⑥增加退火的溫度

4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性不夠

   ①增加退火的溫度。

   ②減少退火及延伸時(shí)間。

   ③降低引物和Taq  DNA聚合酶的濃度。

  ④改變Mg++的濃度

預(yù)防PCR擴(kuò)增中污染的措施：

  1、擴(kuò)增所用的試驗(yàn)要少量分裝保存，最好為一次實(shí)驗(yàn)的使用。

  2、實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)人員要穿工作服、戴手套，尤其是RT-PCR擴(kuò)增的過程中必須戴手套。

  3、實(shí)驗(yàn)中加取標(biāo)本和反應(yīng)試劑要迅速、準(zhǔn)確、盡量減少標(biāo)本取樣的次數(shù)，并就近操作，避免遠(yuǎn)距離一樣，陽性對(duì)照最后加入。

  4、PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中所使用的器械要專用，不可竄用。

  5、實(shí)驗(yàn)中使用的加樣頭，標(biāo)本處理和擴(kuò)增用的離心管要高壓滅菌消毒。

  6、加權(quán)樣本和擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，不要反復(fù)抽吸和空吸，避免產(chǎn)生氣溶膠，污染實(shí)驗(yàn)室。

  7、要嚴(yán)格執(zhí)行先加入反映實(shí)際，后加入標(biāo)本DNA。

  8、擴(kuò)增過程中的流程要有次序，避免已經(jīng)入下步驟的擴(kuò)增標(biāo)本，返回到前一步驟，造成污染。

PCR擴(kuò)增過程中污染的主要來源

核算擴(kuò)增是一項(xiàng)很有效的技術(shù)，但同時(shí)優(yōu)勢(shì)很靈敏的方法以至于很容易出現(xiàn)假陽性的反應(yīng)，這種假陽性反應(yīng)的干擾主要產(chǎn)生于3個(gè)方面

  1、應(yīng)用DNA質(zhì)粒作為核算擴(kuò)增反應(yīng)的陽性對(duì)照。

  2、DNA由林勇標(biāo)本，培養(yǎng)物或由被污染的試劑延續(xù)下來。

  3、擴(kuò)增DNA的污染（即PCR產(chǎn)物）。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染的主要排出方法：

補(bǔ)骨脂類：

補(bǔ)骨脂類過去主要用于治療牛皮癬。其可悲紫外線火花并嵌入DNA分子中，抑制堿基配對(duì)。

補(bǔ)骨脂類從反應(yīng)開始既包含于PCR混合物在熱循環(huán)液中，擴(kuò)增之后未打開的反應(yīng)關(guān)用紫外線處理之。這種處理使補(bǔ)骨脂素嵌入新行程DNA分子中，并破壞了被處理的DNA重新擴(kuò)增的可能性。但有一個(gè)缺點(diǎn)是增加補(bǔ)骨脂素的量影響DNA在瓊脂糖凝膠中涌動(dòng)以致給出一個(gè)比預(yù)期要高的分子量，還有，補(bǔ)骨脂素處理過的DNA嵌入溴化乙錠不如未處理的DNA好。以致染色減弱，然而以內(nèi)探針?biāo)�取得的雜交限號(hào)則似因補(bǔ)骨脂素的處理二周明顯的影響。

高濃度的補(bǔ)骨脂素可以輕度以致PCR擴(kuò)增反應(yīng)，加入10%甘油能夠克服這個(gè)問題。