組織AMPK 激酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到AMPK 磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生 ADP 過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用比色法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析組織裂解樣品中 AMPK 活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或完全純化酶樣品中 AMPK 激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其為從酵母到人體高度進(jìn)化保留的激酶復(fù)合物，由3個(gè)亞體，α、β、γ構(gòu)成：其中γ亞體有4個(gè)胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）結(jié)構(gòu)域，又稱為巴特曼（Bateman）結(jié)構(gòu)域，以探測AMP和ATP的比例；α亞體含有催化結(jié)構(gòu)域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 復(fù)合物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亞體都有不同異構(gòu)體形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2 和γ3。其功能在于保持細(xì)胞能量內(nèi)環(huán)境恒定：促進(jìn)脂肪酸β氧化、抑制膽固醇合成、促進(jìn)肌肉葡萄糖吸收和調(diào)節(jié)胰島素分泌等。AMPK在肝臟、腦和肌肉組織中高度表達(dá)。其磷酸化目標(biāo)序列為 LKKLTRASFFGQ。基于底物LKKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽， 進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）毫升

 裂解液（Reagent B）毫升

 緩沖液（Reagent C）毫升

 酶促液（Reagent D）微升

 反應(yīng)液（Reagent E）微升

 底物液（Reagent F）微升

 陰性液（Reagent G）微升

產(chǎn)品說明書1 份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證 6 月

用戶自備

AMPK 激酶：用于抑制劑篩選

1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析操作的容器分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測樣品準(zhǔn)備

1. 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重 500 毫克組織重量

2. （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

3. （選擇步驟）加入毫升  清理液（Reagent A）清洗

4. （選擇步驟）抽去清理液

5. 移入到一個(gè)液氮凍存管

6. 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

7. 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8. 放進(jìn)一個(gè) 15 毫升錐形離心管

9. 加入置于冰槽里的微升  裂解液（Reagent B） 10．強(qiáng)力渦旋震蕩 30 秒，充分混勻

11. 放進(jìn)冰槽里孵育 30 分鐘，期間每 10 分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩 30 秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>）

12. 即刻放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 10000g

13. 小心移取上清液到新的無菌的 1.5 毫升離心管

14. 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－

GMS30030.1）

15. 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測定準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里

2. 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 1 分鐘，讀數(shù) 6 次（共 5 分鐘），并置零三、 背景對(duì)照測定

1. 移取微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2. 加入微升  酶促液（Reagent D）

3. 加入微升  陰性液（Reagent G）

4. 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘

5. （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零

6. （選擇步驟）取出比色皿

7. 加入微升  反應(yīng)液（Reagent E）

8. 加入微升  底物液（Reagent F）

9. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)） 10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 5 分鐘

四、 樣品測定

1. 移取微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2. 加入微升  酶促液（Reagent D）

3. 加入 5 微升待測樣品（注意：50 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）

4. 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘

5. （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零

6. （選擇步驟）取出比色皿

7. 加入微升  反應(yīng)液（Reagent E）

8. 加入升  底物液（Reagent F）

9. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）
10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 5 分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

單位＝微摩爾 NADH/分鐘
六、酶標(biāo)板測定

1. 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2. 分別移取微升  緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中

3. 分別加入微升  酶促液（Reagent D）

4. 分別加入 5 微升  陰性液（Reagent G）或待測樣品（50 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

5. 輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板

6. 在 30℃溫度下孵育 2 分鐘

7. 分別加入微升  反應(yīng)液（Reagent E）

8. 分別加入微升  底物液（Reagent F）

9. 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

10. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)

11. 活性計(jì)算：

 單位＝微摩爾 NADH/分鐘
七、抑制劑篩選

1. 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品

2. 按下表加入試劑

3. 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻

4. 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 30 分鐘

5. 分別加入微升  酶促液（Reagent D）

6. 分別加入微升  反應(yīng)液（Reagent E）

7. 分別加入微升  底物液（Reagent F）

8. 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

9. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：獲得初始吸光讀數(shù)（OD） 10．放進(jìn)    30℃培養(yǎng)箱里孵育    30        分鐘11．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：獲得終點(diǎn)吸光讀數(shù)（OD）

12．實(shí)際吸光讀數(shù)：初始吸光讀數(shù)（OD）—終點(diǎn)吸光讀數(shù)（OD）

13．抑制活性計(jì)算：

1)

2)IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度

3） 直接構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為吸光讀數(shù) OD；橫座標(biāo)（X 軸）為已知抑制劑濃度 

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為 25 次操作，包括背景操作

2. 操作時(shí)，須戴手套

3. 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1 次

4. 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5. 樣品須澄清，至關(guān)重要

6. 加入  底物液（Reagent F）后 3 秒內(nèi)即刻比色測定

7. 測定值由高到低變化；測定可持續(xù) 30 分鐘

8. 比色測定后，比色皿須清洗徹底

9. 樣本測定 0 分鐘讀數(shù)高于 5 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10. 建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供  Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－

GMS30030.1）

11. 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度